Мета: дозволяє диференціювати бактерії за біохімічними властивостями їхньої клітинної стінки, визначити морфологічні та тинкторіальні властивості.

1. Приготувати фіксований мазок

2. На мазок кладемо фільтрувальний папір

3. На папір капнути 1-2 краплі генціанвіолету і пофарбувати протягом 1 хвилини

4. Фарбу разом з папером змити (промивати водою не треба)

5. Забарвити препарат розчином Люголя на фільтр. папері протягом 1 хвилини

6. Фарбу злити і на мазок із фільтр. Папером капнути на 0,5 хвилини етилового спирту

7. Промити препарат водою

8. Пофарбувати розведеним фуксином Циля протягом 2 хвилин також на фільтрувальному папері

9. Промити водою, підсушити та промікроскопувати

Грам "+" забарвлюються в синій колір, грам "-" в рожевий.

Методика приготування мазка з культури, вирощеної на щільному поживному середовищі.

Приготувати робочий стіл → Запалити спиртівку і прожарити бактеріальну петлю → Петлею нанести на предметне скло краплю води → Петлю обпалити → Петлею взяти невелику кількість досліджуваного матеріалу, дотримуючись правил стерильності → Перенести матеріал у краплю води на предметному склі і ретельно розтерти, щоб вийшло Петлювново обпалити → Зафіксувати мазок, провівши над полум'ям 3-4 рази → Дати підсохнути мазок → Пофарбувати.

Дайте характеристику ГР(+) та ГР(-) бактеріям.

Відмінності ГР(+) та ГР(-) бактерій

Відношення до фарбування за Грамом – важлива для систематики ознака бактерій, яка залежить від структури та хімічного складу клітинної стінки бактерій. Виділяють дві великі групи - грампозитивні (грам +) і грамнегативні (грам-) бактерії. Стінка грампозитивних бактерій після фарбування за Грамом зберігає комплекс йоду з генціановим фіолетовим (забарвлені в синьо-фіолетовий колір), грамнегативні бактерії втрачають цей комплекс і відповідний колір після обробки і забарвлені в рожевий колір за рахунок дофарбування фуксином.

Особливості клітинної стінки грампозитивних бактерій.

Потужна, товста, нескладно організована клітинна стінка, у складі якої переважають пептидоглікан та тейхоєві кислоти, немає ліпополісахаридів (ЛПС), часто немає діамінопімелінової кислоти.

Особливості клітинної стінки грамнегативних бактерій.

Клітинна стінка значно тонша, ніж у грампозитивних бактерій, містить ЛПС, ліпопротеїни, фосфоліпіди, діамінопімелінову кислоту. Влаштована складніше - є зовнішня мембрана, тому клітинна стінка тришарова.

2. Вкажіть на запропонованій чашці з ЖСА одну з диференційно-діагностичних ознак.

Назвіть ознаки, які є диференційно-діагностичними для стафілококів.

Диференційно - діагностична ознака: при зростанні стафілококиутворюють пігмент: золотистий лимонно-жовтий або білий, який не розчиняється у воді та розчиняється в ацетоні, ефірі, спирті.

На МПА колонії стафілокока опуклі, круглі, непрозорі, блискучі, розміром 2-4 мм із рівними краями. На агарі з кров'ю довкола колонії утворюється зона гемолізу. На бульйоні – рівномірне помутніння та осад на дні.

На ЖСА навколо колоній виявляється продукція лецитинази – каламутна зона та «райдужні» віночки.

3. Через 10 років після перенесеного висипного тифу у хворого без повторного зараження виникли симптоми цього захворювання. Назвати це явище та використовувані методи діагностики.

Рецидив - повторення хвороби після повного одужання.

Основним методом лабораторної діагностики висипного тифу є серологічні реакції: аглютинації, зв'язування комплементу та непрямої гемаглютинації. Реакція аглютинації зі специфічним діагностикумом з рикетсій Провачека є високочутливою і стає позитивною на 3-5-й день. Діагностичним титром антитіл вважають розведення сироватки 1:100-1:160. Антитіла зникають протягом року після захворювання. РЗК буває позитивною з 7-8-го дня хвороби; титр антитіл максимальний до 12-14 дня, а потім спостерігається повільне зниження. Невелика кількість комплемент-зв'язуючих антитіл виявляють довгі роки. РНГА стає позитивною на 7-8 день захворювання. Діагностичним вважають титр антитіл 1:160 - І:200 за умови його подальшого наростання при повторній постановці РНДА.

КВИТОК 5

1. Пофарбуйте препарат метиленової синю, промікроскопуйте, зробіть висновок.

Розкажіть методику приготування мазка із культури, вирощеної на ЖПС.

Забарвити препарат метиленової синю:

1. препарат покласти на поверхню досліджуваним матеріалом нагору;

2. піпеткою нанести на препарат р-рбарвника на 5-7 хв;

3. фарбу злити, промити водою;

4. просушити;

5. м/с із імерсією.

Для приготування мазка необхідно мати:

Чисте знежирене предметне скло.

Бактеріологічну петлю

Культуру, вирощену на щільному живильному середовищі - агарі, або рідкому середовищі - бульйоні.

Спиртування.

Набір барв.

Якщо мазок готується з рідкого живильного середовища, то краплю культури наносять петлею на предметне скло.

2. Виберіть культури з характерним для сальмонел зростанням на двоцукровому середовищі.

Перерахуйте та охарактеризуйте дослідження для диференціації цього збудника.

3.У хворого було взято мазок із зіва і посіяний на живильне середовище. Для фаготипування був використаний стафілококовий бактеріофаг, але зони пригнічення росту через 24 години інкубації не з'явилося.

Дати висновок за цими даними.

КВИТОК 6

1. Промікроскопітуйте готовий препарат, зробіть висновок.

Розкажіть пристрій та правила роботи зі світловим мікроскопом.

При роботі з мікроскопом необхідно дотримуватись операцій у наступному порядку:

1. Працювати з мікроскопом слід сидячи;

2. Мікроскоп оглянути, витерти від пилу м'якою серветкою об'єктиви, окуляр, дзеркало;

3. Мікроскоп встановити перед собою, трохи ліворуч на 2-3 см від краю столу. Під час роботи його не зрушувати;

4. Відкрити повністю діафрагму, підняти конденсор у крайнє верхнє положення;

5. Роботу з мікроскопом завжди розпочинати з малого збільшення;

6. Опустити об'єктив 8 х у робоче положення, тобто на відстань 1 см від предметного скла;

7. Дивлячись одним оком в окуляр і користуючись дзеркалом із увігнутою стороною, направити світло від вікна в об'єктив, а потім максимально й рівномірно висвітлити поле зору;

8. Покласти мікропрепарат на предметний столик так, щоб об'єкт, що вивчається, знаходився під об'єктивом. Дивлячись збоку, опускати об'єктив за допомогою макрогвинта доти, доки відстань між нижньою лінзою об'єктива і мікропрепаратом не стане 4-5 мм;

9. Дивитись одним оком в окуляр і обертати гвинт грубого наведення на себе, плавно піднімаючи об'єктив до положення, при якому добре видно зображення об'єкта. Не можна дивитися в окуляр та опускати об'єктив. Фронтальна лінза може розчавити покривне скло, і на ній з'являться подряпини;

10. Пересуваючи препарат рукою, знайти потрібне місце, розташувати його у центрі поля зору мікроскопа;

11. Якщо зображення не з'явилося, треба повторити всі операції пунктів 6, 7, 8, 9;

12. Для вивчення об'єкта при великому збільшенніСпочатку потрібно поставити вибрану ділянку в центр зору мікроскопа при малому збільшенні. Потім поміняти об'єктив на 40 х, повертаючи револьвер, щоб він зайняв робоче становище. За допомогою мікрометренного гвинта досягти хорошого зображення об'єкта. На коробці мікрометрного механізму є два ризики, а на мікрометренному гвинті - точка, яка повинна постійно перебувати між ризиками. Якщо вона виходить за межі, її необхідно повернути в нормальне становище. При недотриманні цього правила мікрометренний гвинт може перестати діяти;

13. Після закінчення роботи з великим збільшенням, встановити мале збільшення, підняти об'єктив, зняти з робочого столика препарат, протерти чистою серветкою всі частини мікроскопа, накрити поліетиленовим пакетом і поставити в шафу.

2. Зробіть облік реакції зв'язування комплементу (Реакція Вассермана). Назвіть мету реакції і перерахуйте інгредієнти, що використовуються.

Реакція Вассермана(RW), або ЕРС (експрес-діагностика сифілісу) - метод діагностики сифілісу

Для постановки реакції необхідні такі інгредієнти: 1) досліджувана сироватка; 2) антигени; 3) комплемент; 4) гемолітична сироватка; 5) еритроцити барана.

Усі інгредієнти для реакції Вассермана беруть у однаковому обсязі – 0,5 або 0,25 мл.

Ступінь позитивності реакції Вассермана прийнято позначати кількістю хрестів +++ повна затримка гемолізу, рідина не забарвлена, всі еритроцити в осаді; ++ виражена затримка гемолізу, рідина рожева, еритроцити в осаді; + + Часткова затримка гемолізу, рідина пофарбована інтенсивно, осад еритроцитів ясно видно; + слабка затримка гемолізу, рідина інтенсивно забарвлена, незначний осад, слабо помітний; - повний гемоліз, рідина пофарбована інтенсивно, осаду немає

3. До мікробіологічної лабораторії надійшов матеріал – біоптат зі слизової оболонки шлунка з клінічним діагнозом: виразковий гастродуоденіт. При посіві досліджуваного матеріалу було виділено - H. PYLORI.Методика взяття біоптату зі слизової шлунка і 12 - палої кишки.

ПЛР зазвичай дає позитивний (збудник є) чи негативний результат (збудника немає). Метод ПЛР дозволяє виявити навіть мізерно малу кількість хелікобактерпілоре з метою прогнозування захворювання, виявлення можливої ​​схильності до виразкової хвороби, гастриту або раку шлунка.

КВИТОК 7

1. Промікроскопуйте та опишіть морфологічні ознаки бактерій, із запропонованих препаратів (№ 1,2). Дайте характеристику різним морфологічним групам.

за зовнішньому виглядубактерії поділяються на три форми: паличкоподібні, кулясті (коки) та звивисті (вібріони та спірили).

Кокові форми розрізняються за формою поділу та розташування в мазках. Вони поділяються на одній, двох, трьох і більше взаємно перпендикулярних площинах. При розподілі в одній площині вони розташовуються парами (диплококи) або ланцюжками (стрептококи); у двох площинах - по чотири (тетракоки), у трьох площинах утворюють пакети (сарцини); при безладному розподілі розташовуються поодиноко (мікрококи) або у вигляді грон винограду (стафілококи). Звивисті форми мають вигляд спіралі. Мікроорганізми паличкоподібної форми поділяються на бактерії, бацили та клостридії.

До бактерій відносяться паличкоподібні мікроорганізми, що не утворюють суперечки (кишкова паличка, сальмонели, збудники туберкульозу тощо).

До бацил і клостридій (лат. closter - веретено) належать мікроби, що утворюють суперечки (сибірка, правцева палички, збудники анаеробної інфекції).

За формою паличкоподібні бактерії бувають короткими, довгими або середніх розмірів: із закругленими (більшість паличок), загостреними (фузобактеріями), обрубаними (сибірковою паличкою) і булавоподібними (коринебактеріями) кінцями. Деякі бактерії можуть утворювати розгалуження у вигляді бічних виростів (мікобактерії туберкульозу).

За взаємним розташуванням паличкоподібні форми розподіляються на три підгрупи:

диплобацили та диплобактерії розташовуються попарно; стрептобактерії та стрептобацили - ланцюжками; безладно розташовані бактерії та бацили - у вигляді римських цифр II, V і т.д.

Звивисті форми бактерій. До цієї групи належать вібріони, спірили та спірохети.

Вібріони - вигин клітини дорівнює 1/3-1/4 завитка спіралі, що мають вигляд коми (холерний вібріон).

Спірили мають вигини з одним або декількома обертами спіралі.

Спірохети мають штопороподібну форму, розміри коливаються у великих межах (ширина 0,3-1,5 мкм та довжина 7 – 500 мкм).

Паличкоподібні форми бактерій, подібно кокам, розташовуються по довжині парами - диплобактерії або ланцюжками - стрептобактерії. Паличкоподібні форми можуть бути прямі та викривлені, строго циліндричні та нерівномірно потовщені, з кінцями закругленими, загостреними або обрубаними.

У мікробіології забарвлення за Грамом має велике значення. Її застосовують для діагностики інфекційних захворювань, виявлення патогенності бактерій. Метод дозволяє визначити подібні за формою та розміром бактерії, які відносяться до різним видамта пологів.

Забарвлення бактерій за Грамом - складний метод, у якому застосовують два види забарвлення: основний та додатковий. У процесі виконання маніпуляції застосовують знебарвлювальні речовини, до яких належать спирти та кислоти.

У мікробіології забарвлення за Грамом проводять трифенілметановою групою барвників. До неї відносяться генціанові, метиловий синій, кристалвіолет. Різні видиБактерій дають різні забарвлення, утворюючи міцні сполуки з барвниками.

Забарвлення

У мікробіології забарвлення за Грамом буває двох видів: грампозитивне і грамнегативне. У першому випадку мікроорганізми дають міцні сполуки з барвниками та йодом. Під час аналізу вони не знебарвлюються під впливом зі спиртом, через що не змінюють свого первісного фіолетового відтінку.

Грамнегативні забарвлення утворюються при дії з йодом і легко руйнуються під дією йоду. В результаті мікроби знебарвлюються, а потім набувають червоного відтінку.

Підготовка матеріалу

За правилами мікробіології, забарвлення за Грамом вимагає попередньої підготовки матеріалів. Його необхідно розподілити тонким шаром на поверхні скла. Потім мазок підсушують і після повного висихання фіксують. При цьому мазок закріплюється на склі, що дозволяє унеможливити змивання бактерій барвниками. До того ж, мертві мікроорганізми забарвлюються краще, ніж живі.

Після підготовки матеріалу підбирають метод фарбування: фізичний чи хімічний. Перший передбачає вплив високої температурина мікробну клітину. Під час хімічного способу застосовують різні хімічні речовини, що спричиняють коагуляцію протеїнів цитоплазми.

Готують набір для фарбування за Грамом, предметне скло з бактеріями. Їх беруть пінцетом або акуратно пальцями за ребра мазком нагору, потім проводять пару разів над верхом полум'я пальника. Процес повинен займати кілька секунд.

Процес фіксації хімічним методом передбачає використання ацетону, спирту, спеціальних сумішей, рідини Карнуа. Предметне скло з висушеним мазком занурюють у фіксуючу речовину на п'ятнадцять хвилин, потім просушують на повітрі.

Фарбування

Забарвлення мазків за Грамом проводиться за певним алгоритмом.

1. Спочатку на фіксований мазок наносять основний барвник на кілька хвилин. Щоб уникнути появи осаду, процедуру виконують з використанням фільтрувального паперу.
2. Барвник видаляється (зливається), забирається папір. Мазок занурюється в розчин Люголя на дві хвилини або в йодистий розчин Грама до почорніння препарату.
3. Мазок попестить спиртовим розчином або ацетоном, наливаючи і зливаючи його доти, поки мазок не знебарвиться, і рідина не стане чистою. Це займає приблизно від 30 до 60 секунд.
4. Скло ретельно промивають дистильованою водою.

Щоб визначити, чи є в мазку грамнегативні бактерії, додатково проводять фарбування фуксином або сафраніном. Препарати завдають на дві хвилини. Наприкінці процедури скло промивають, висушують.

Результати

Усі грампозитивні мікроорганізми забарвлюються у темно-фіолетовий колір, а грамнегативні – у червоний. Кулясті форми зазвичай відносяться до грампозитивних видів, а звивисті форми - негативно забарвлюються. Паличкоподібні бактерії можуть бути грамнегативними та грампозитивними.

Щоб отримати максимально достовірні результати досліджень, рекомендується застосовувати добові культури та свіжоприготовлені розчини для фарбування.

Механізм забарвлення дозволяє побачити та оцінити фізико-хімічні особливості будови цитоплазми, клітинні стінки грампозитивних та грамнегативних бактерій. У перших міститься багато рибонуклеїнової кислоти, білків у цитоплазмі, а в клітинних стінках – пептидоглікану. Через це під час обробки мазків генціанвіолетом та Люголем у грампозитивних видів бактерій утворюється міцна сполука іонів йоду та барвника.

При обробці спиртами грампозитивні мікроорганізми утримують барвник, а грамнегативні – знебарвлюються та забарвлюються додатково розведеним фуксином у червоний відтінок. Деякі бактерії здатні фарбуватися лише на стадії зростання.

Застосування

Забарвлення за Грамом проводять при аналізі виду мікроорганізмів у мазках з піхви та слини. Цей спосіб дозволяє визначити вид мікроорганізмів у калі, у плевральній, перитонеальній рідині і не тільки. Будь-які рідини, де можуть бути бактерії, досліджують даним методом. Після проведення фарбування лікарі підбирають метод лікування, призначаючи препарати, здатні впливати на грампозитивні або грамнегативні бактерії.

Мікробіологія. Забарвлення за Грамом: барвники, проведення, результати — все про подорожі на сайт

(або метод Граму)— емпірично виведений метод розрізнення бактерій за допомогою фарбування їх певним методом на дві великі групи: Грампозитивні та Грамнегативні), що відрізняються хімічними та фізичними властивостями їхньої клітинної стінки.

Етимологія

Метод називається на честь його винахідника, датського вченого Ганса Християна Грама (1853-1938), який розробив цей метод у 1884 році, щоб розрізнити бактерії Pneumococcusі Klebsiella pneumoniae.

Використання

Забарвлення за Грамом – одна з найкорисніших фарбуючих процедур у лабораторних дослідженнях у мікробіології. Процедура широко використовується як інструмент для розрізнення Грам-негативних та Грам-позитивних бактерій, які зазвичай є першим кроком у визначенні ідентичності специфічного бактеріального зразка.

У медицині фарбування за Грамом виконується при аналізі крові або біопсії, коли підозрюється інфекція. Цей метод набагато швидший, ніж культура, і особливо важливий, коли визначення типу інфекції необхідне для прогнозу та вибору методу лікування. Наприклад, при діагностиці цереброспінальної рідини менінгітом та рідини суглобів на септичний артрит.

При аналізі, наприклад, Коки і спороносні форми бактерій, а також дріжджі — грам-позитивні і забарвлюються в синювато-чорний (темно-синій) колір, більшість інших бактерій — грамнегативні і забарвлюються в червоний колір, ядра клітин еукаріотів набувають яскраво-червоного кольору, а цитоплазма – рожевого.

Техніка проведення фарбування

Забарвлення за Грамом відноситься до складного способу фарбування, коли на мазок впливають двома барвниками, з яких один є основним, а інший - додатковим. Крім барвників при складних способах фарбування застосовують знебарвлюючі речовини: спирт, кислоти та ін. Для фарбування за Грамом частіше використовують барвники трифенілметанової групи: генціановий, метиловий фіолетовий або кристал віолет. Грам-позитивні (грам (+)) мікроорганізми дають міцну сполуку із зазначеними барвниками та йодом. При цьому вони не знебарвлюються при дії на них спиртом, внаслідок чого при додатковому фарбуванні фуксином Грам (+) мікроорганізми не змінюють спочатку приєднаний фіолетовий колір.

Грамнегативні (грам (-)) мікроорганізми утворюють з основними барвниками та йодом сполуки, що легко руйнується під дією спирту. В результаті мікроби знебарвлюються і потім забарвлюються фуксином, набуваючи червоного кольору.

Підготовка матеріалу для фарбування

Матеріал досліджуваного розподіляють тонким шаром поверхні добре знежиреного скла. Приготовлений мазок висушують на повітрі та після повного висихання фіксують.

Фіксація

При фіксації мазок закріплюється на поверхні скла, тому при подальшому фарбуванні препарату клітини не змиваються. Крім того, убиті мікробні клітини забарвлюються краще, ніж живі. Розрізняють фізичний спосіб фіксації, в основу якого покладено дію високої температури на клітину, та хімічні способи, що передбачають застосування хімічних засобів, що викликають коагуляцію білків цитоплазми.

Фізичний спосіб фіксації Склоз препаратом беруть пінцетом та плавним рухом проводять 2-3 рази над верхньою частиною полум'я пальника. Весь процес фіксації повинен займати трохи більше 2 з. Надійність фіксації перевіряють таким прийомом: вільну від мазка поверхню скла прикладають до тильної поверхні лівої кисті. При правильній фіксації скло має бути гарячим, але не викликати відчуття опіку (70-80°С).

Хімічний спосіб фіксації Дляфіксації мазків застосовують метиловий спирт, ацетон, суміш Нікіфорова (суміш етилового спирту 96% та наркозного ефіру у співвідношенні 1: 1), рідина Карнуа (етилового спирту 96% - 60%, хлороформу 30%, крижаної оцтової кислоти 10%). Скло з висушеним мазком занурюють у склянку з фіксуючою речовиною на 10-15 хвилин і потім висушують на повітрі.

Процес фарбування

1. На фіксований мазок наливають один із основних барвників на 2-3 хвилини. Щоб уникнути осаду, фарбують через фільтрувальний папір.
2. Зливають фарбу, акуратно видаляють фільтрувальний папір. Мазок заливають на 1-2 хв розчином Люголя або йодистим розчином, за Грамом (водний розчин йодиду калію та кристалічного йоду у співвідношенні 2: 1) у почорніння препарату.
3. Розчин зливають, мазок прополіскують 96° етиловим спиртом або ацетоном, наливаючи та зливаючи його, поки мазок не знебарвиться і рідина стікає, не стане чистою (приблизно 20-40-60 секунд).
4. Ретельно промивають стекла в проточній або дистильованій воді 1-2 хв.
5. Для виявлення грамнегативних бактерій препарати додатково фарбують фуксином або сафраніном (2-5 хв).
6. Промивають у проточній воді та висушують фільтрувальним папером.

Всі відомі бактерії за здатністю фарбуватись за методом Грама поділяються на позитивні та негативні. Цей поділ залежить від особливостей будови та фарбування їх клітинної стінки.

Метод дозволяє розділити всі види залежно від густини будови зовнішньої оболонки клітини мікроорганізму на:

• більш стійких до дії довкілля, впливу антибіотиків;
• менш стійких.

Першим ученим, який припустив, що деякі методи, які раніше використовуються тільки в ботаніці, можуть використовуватися в мікробіології, був Роберт Кох.

У 1884 р. Крістіан Грам, датський біолог, що спеціалізується на фарбуванні тканин, вперше спробував метод диференціювання.

Відкриття дозволило розділити всі існуючі види мікроорганізмів на грампозитивні та грамнегативні, що послужило поштовхом для нового ступеня розвитку науки в галузі мікробіологічних досліджень. Це також дало можливість виявляти стійкість патогенних видів до лікарських препаратів, передбачати їхню поведінку, а що найголовніше – розробляти антибіотики нового покоління, здатні перемогти хворобу.

Будова клітинної стінки

Оболонка будь-якої бактерії складається із спеціальної речовини – муреїну. Його молекула є ланцюгами полісахаридів, розташованих паралельно. Полісахариди, своєю чергою, пов'язані між собою ланцюгами амінокислот, розташованих перехресно.

Цей зв'язок зумовлює міцність, гнучкість оболонки, її здатність тримати форму.Своєрідна плетена сітка є захистом внутрішнього шару мікроорганізму від дії руйнівних факторів, що перешкоджає попаданню всередину води. При цьому просвіти між ланцюжками дозволяють клітині поглинати поживні речовини, як пори.

У позитивних за Грамом мікроорганізмів оболонка товща, міцніша, що обумовлено включенням до її складу білка.

У негативних видів будова клітинної оболонки значно складніше, що дозволяє їй бути захищеною від дії таких середовищ, як слина, шлунковий сік, інші рідини з лізоцимом, що міститься в них, - ферментом, що володіє антибактеріальними властивостями. Зовні більш тонка оболонка оточена плівкою з ліпідів та полісахаридів – гладким поверхневим шаром.

Сутність методу Граму

Основою методу Грама є принцип поділу бактерій на мікроорганізми зі знаками "плюс" і "мінус" за Грамом, ґрунтуючись на різному хімічному складі клітинних стінок мікроорганізмів.

Для визначення грампозитивних та грамнегативних бактерій препарат, нанесений на скло тонким рівномірним шаром, спочатку фіксують за допомогою нагрівання над пальником. Потім фарбують аніліновим барвником – метиловим фіолетовим. Після чого фіксують йодом, дають підсохнути і змивають спиртом.

• Грампозитивні (Грам +) види набувають яскраво-синього забарвлення.
• Грамнегативні (Грам –) бактерії знебарвлюються.

Заключним етапом є фарбування препарату контрастним барвником червоного кольору, який дозволяє отримати грамнегативні мікроорганізми червоного або рожевого кольору. Це зумовлено тим, що барвник не може проникнути в клітину через її товстий зовнішній шар, забарвлюючи тільки поверхню.

Мертві мікроби набувають яскравішого забарвлення, порівняно з живими.

Характеристика бактерій, позитивних за Грамом

Більшість грампозитивних бактерій є патогенними для людини. Це збудники небезпечних захворювань:

1. Стрептокок (Streptococcus), що викликає тонзиліти, фарингіти, ревматизм.
2. Стафілокок (Staphylococcus) – збудник зараження крові, шкірних гнійних захворювань.
3. Лістерія (Listeria), що викликає листеріоз - запалення мозку.
4. Бацили (Bacillus) – збудники токсикоінфекцій, сибірки.
5. Клостридії (Clostridium), що викликають ботулізм, правець, газову гангрену.

Два останні види є спороутворюючими анаеробами, інші не можуть утворювати суперечку. Деякі здатні фарбуватися лише у фазі активного зростання.

Негативні бактерії за Грамом

Це бактерії, що повністю знебарвлюються після промивання спиртом; в результаті повторного забарвлення сафраніном набувають рожевого або яскраво-червоного кольору. Вони більш стійкі до антитіл, ніж види грамів +.

До грамнегативних відносяться в основному бактерії умовно патогенні, здатні викликати запальні процеси та імунну відповідь в організмі людини за певних умов. Їхня клітинна оболонка, що складається з ліпополісахаридного шару, викликає синтез цитокінів, що сприяє збільшенню токсинів у місці локалізації запалення. Згодом токсини, рознесені з кровотоком, отруйною дією викликають сильні симптоми інтоксикації.

Важлива роль методу Грама у діагностиці захворювань

Метод, що дозволяє відрізнити позитивні бактерії за Грамом та негативні, незамінний при дослідженні людського біологічного матеріалу на виявлення бактеріальної інфекції.

Матеріал, що використовується для діагностики:

• мокротиння дозволяє класифікувати склад мікрофлори носоглотки, виявивши збудників захворювань;
• в аналізі калу виявляють токсини, що виробляються грампозитивними видами;
• мазок із піхви дає можливість порахувати відсоток грамнегативних та позитивних мікробів для діагностики бактеріальних вагінітів;
• плевральна, синовіальна, перинатальна рідини також є досить інформативними.

Метод, впроваджений Крістіаном Грамом, дозволив науці далеко просунутися у знаннях про будову мікробів, про їх захисні механізми. Він дозволив ввести найвірнішу систему поділу бактерій на позитивні та негативні, що використовується досі для діагностики інфекційних хвороб.

Надіслати свою гарну роботу до бази знань просто. Використовуйте форму нижче

Студенти, аспіранти, молоді вчені, які використовують базу знань у своєму навчанні та роботі, будуть вам дуже вдячні.

Розміщено на http://allbest.ru

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ РЕСПУБЛІКИ БІЛОРУСЬ

БІЛОРУСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

БІОЛОГІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Забарвлення за Грамом

Вівчарової Ганни Ігорівни

студентки 3 курсу,

спеціальність «Біологія»

Мінськ, 2016

Вступ

1. Техніка проведення фарбування

1.1 Підготовка матеріалу для фарбування

1.2 Фіксація

1.2.1 Фізичний спосіб фіксації

1.2.2 Хімічний метод фіксації

1.3 Процес фарбування мазків

2. Техніка фарбування бактерій у гістологічних зрізах за Грамом-Вейгертом

2.1 Модифікація Hucker

2.2 Модифікація Burke

2.3 Модифікація Kopeloff-Beerman

2.4 Модифікація Preston-Morrell

3. Помилки

3.1 Грампозитивні бактерії забарвилися у червоний колір

3.2 Грамнегативні бактерії пофарбувалися у синій колір

ВСТУП

Залежно від будови клітинної стінки прокаріоти, що належать до еубактерій, поділяються на дві великі групи. Було виявлено, що якщо фіксовані клітини еубактерій обробити спочатку кристалічним фіолетовим, а потім йодом, утворюється забарвлений комплекс.

При подальшій обробці спиртом залежно від будови клітинної стінки доля комплексу різна: у про грампозитивних видів цей комплекс утримується клітиною, і останні залишаються забарвленими, у грамнегативних видів, навпаки, пофарбований комплекс вимивається з клітин, і вони знебарвлюються. (Цей спосіб був вперше запропонований в 1884 датським ученим Х. Грамом (Ch. Gram), що займався фарбуванням тканин. Пізніше він був використаний для бактерій).

У деяких еубактерій позитивна реакція при фарбуванні описаним вище способом властива тільки клітинам, що знаходяться на стадії активного росту. З'ясовано, що забарвлений комплекс утворюється на протопласті, але його утримування клітиною або вимивання з неї при подальшому обробленні спиртом визначаються особливостями будови клітинної стінки. Фарбування препаратів збільшує чутливість мікроскопії, тому що незабарвлені бактерії погано помітні навіть при збільшенні 400-1000.

Найбільш поширене диференціальне забарвлення за Грамом, хоча застосовують і монохромні забарвлення. Забарвлення за Грамом дозволяє відрізнити бактерії, чия товста клітинна стінка практично повністю складається з пептидоглікану (грампозитивні), від бактерій, чия клітинна стінка крім тонкого шару пептидоглікану має зовнішню мембрану, що складається з ліпопротеїдів і ліпополісахаридів. Основний барвник (наприклад, кристалічний фіолетовий) міцно фіксується в стінці грампозитивних бактерій, надаючи їм синяво-чорний колірі легко вимивається спиртом (або ацетоном) зі стінки грамнегативних бактерій, після чого вони дофарбовуються контрастним барвником (наприклад, сафраніном) в червоний колір.

Забарвлення по Граму незамінне для дослідження мазків мокротиння. Якщо мокрота отримана правильно, у ній виявляють щонайменше 25 нейтрофілів і менше 10 епітеліальних клітин на полі зору при малому збільшенні. Більша кількість епітеліальних клітин та різноманітність типів бактерій свідчать про те, що мокротиння забруднена вмістом ротоглотки. Хоча відрізнити нормальну мікрофлору від патогенних бактерій нерідко буває важко, забарвлення мазка за Грамом дає цінну інформацію, якщо патогенна бактерія має будь-яку доступну для визначення ознаку (біологічний сигнал). Наприклад, при бактеріальному вагінозів мазку з піхви видно епітеліальні клітини, усіяні грампозитивними бактеріями.

Мікроскопію мазків калу, пофарбованих за Грамом, використовують як відбіркове дослідження. При виявленні нейтрофілів приступають до бактеріологічного дослідження та визначення токсинів, що виробляються. Clostridium difficile .

Забарвлення за Грамом використовують також для виявлення бактерій і лейкоцитів у СМР, синовіальної, плевральної та перитонеальної рідини. Нижня межа чутливості методу становить 10 000 бактерій на 1 мл.

Щоб збільшити чутливість, досліджувану рідину центрифугують і готують мазок забарвлений осаду. Ця процедура називається збагаченням матеріалу. Вона проста і особливо цінна для виявлення бактерій та лейкоцитів у СМР та кислотостійких бактерій у мокротинні.

1. ТЕХНІКА ПРОВЕДЕННЯ фарбування

Забарвлення за Грамом відноситься до складного способу забарвлення, коли на мазок впливають двома барвниками, з яких один є основним, а інший - додатковим. Крім барвників при складних способах фарбування застосовують знебарвлюючі речовини: спирт, кислоти та ін.

Для фарбування за Грамом частіше використовують барвники трифенілметанової групи: генціановий, метиловий фіолетовий або кристалвіолет. Грампозитивні Грам (+) мікроорганізми дають міцну сполуку із зазначеними барвниками та йодом. При цьому вони не знебарвлюються при дії на них спиртом, внаслідок чого при додатковому забарвленні фуксином Грам (+) мікроорганізми не змінюють спочатку прийнятий фіолетовий колір.

Грамнегативні Грам (?) мікроорганізми утворюють з основними барвниками і йодом з'єднання, що легко руйнується під дією спирту. В результаті мікроби знебарвлюються, а потім фарбуються фуксином, набуваючи червоного кольору.

1.1 Підготовка матеріалу для фарбування

Досліджуваний матеріал розподіляють тонким шаром поверхнею добре знежиреного предметного скла.

Приготовлений мазок висушують на повітрі та після повного висихання фіксують. Гістологічні зрізи готують за рутинною методикою, фіксуючи шматочки тканин у формаліні та заливаючи до парафіну.

1.2 Фіксація

При фіксуванні мазок закріплюється на поверхні предметного скла, і тому при подальшому забарвленні препарату мікробні клітини не змиваються. Крім того, вбиті мікробні клітини забарвлюються краще, ніж живі.

Розрізняють фізичний спосіб фіксації, в основу якого покладено вплив високої температури на мікробну клітину, та хімічні способи, що передбачають застосування хімічних засобів, що викликають коагуляцію білків цитоплазми.

1.2.1 Фізичнийспосібфіксації

Предметне скло з препаратом беруть пінцетом або I та II пальцями правої руки за ребра мазком догори та плавним рухом проводять 2-3 рази над верхньою частиною полум'я пальника. Весь процес фіксації повинен займати трохи більше 2 з.

Надійність фіксації перевіряють наступним прийомом: вільну від мазка поверхню предметного скла прикладають до тильної поверхні лівої кисті. При правильному фіксуванні мазка скло повинно бути гарячим, але не викликати відчуття опіку (70-80 ° С).

1.2.2 Хімічнийспосібфіксації

Для фіксації мазків застосовують метиловий спирт, ацетон, суміш Нікіфорова (суміш етилового спирту 96% та наркозного ефіру у співвідношенні 1:1), рідина Карнуа (етилового спирту 96% - 60%, хлороформу 30%, крижаної оцтової кислоти 10%). Предметне скло з висушеним мазком занурюють у склянку з фіксуючою речовиною на 10-15 хвилин і потім висушують на повітрі.

1.3 Процес фарбування мазків

1 На фіксований мазок наливають один з основних барвників на 2 або 3 хвилини. Щоб уникнути опадів, фарбують через фільтрувальний папір.

1. Зливають фарбу, акуратно видаляють фільтрувальний папір. Мазок заливають на 1-2 хв розчином Люголя або йодистим розчином за Грамом (водний розчин йодиду калію та кристалічного йоду у співвідношенні 2:1) на 1-2 хвилини до почорніння препарату.

2. Розчин зливають, мазок прополіскують 96° етиловим спиртом або ацетоном, наливаючи і зливаючи його, поки мазок не знебарвиться і стікає рідина не стане чистою (приблизно 20-40-60 секунд).

3. Ретельно промивають скла в проточній або дистильованій воді 1-2 хв.

4. Для виявлення грамнегативної групи бактерій препарати додатково забарвлюють фуксином або сафраніном (2-5 хв).

5. Промивають у проточній воді та висушують фільтрувальним папером.

2. Техніка фарбування бактерій у гістологічних зрізах за Грамом-Вейгертом

1. Депарафіновані зрізи доводять до води.

2. Фарбують 20 хв в 1% розчині парарозаніліну або основного фуксину в 1 % оцтовій кислоті (розчин барвника нагрівають до кипіння, охолоджують та фільтрують).

3. Промивають у 3 змінах дистильованої води.

4. Фарбують 5 хв 1% кристалічного фіолетового в дистильованій воді.

5. Швидко обполіскують в 1% розчині натрію хлориду.

6. Обробляють 30 з суміші: 1 частина йоду + 2 частини йодиду калію + 100 частин дистильованої води.

7. Промокають фільтрувальним папером.

8. Диференціюють, наносячи на зріз суміш рівних обсягів аніліну та ксилолу (1 - 2 мл); розчини зливають до тих пір, поки хмарки барвника не перестануть відходити від зрізу.

9. Проводять через 3 зміни ксилолу

10. Залити бальзамом або будь-якою смолою, розчиненою в ксилолі.

Результат: грампозитивні бактерії синьо-чорні, фібрин фіолетовий, червоні ядра.

2.1 Модифікація Hucker

гістологічний фарбування бактерія

2.2 Модифікація Burke

2. Забарвлення основним барвником. На мазок наливають розчин і додають 2-3 краплі розчину b (2-3 хв).

4. Промити водопровідною водою та обережно видалити надлишок води фільтрувальним папером (не сушити).

7. Дофарбувати додатковим барвником. (5-10 сік).

2.3 Модифікація Kopeloff-Beerman

1. Мазок висушують на повітрі без нагрівання. Чи не фіксують.

2. Забарвлення основним барвником. Розчини а та b змішують у співвідношенні 15:4. Наносять на мазок (5 хв і більше).

3. Змивають розчином Люголю. Наливають на мазок розчин люголя (2 хв або більше).

4. Струсіть надлишок розчину Люголя. Чи не промивати.

5. Знебарвити, додаючи по краплях суміш ацетону та ефіру до припинення відходження барвника (зазвичай близько 10 сек).

6. Препарат висушити на повітрі.

7. Дофарбувати додатковим барвником. (1-2 хв).

8. Промити та підсушити препарат.

2.4 Модифікація Preston-Morrell

1. На фіксований мазок нанести основний барвник (1 хв).

2. Злити барвник, промити препарат водопровідною водою (трохи більше 2 сек).

3. Помістити препарат у розчин Люголю (1 хв).

4. Промити водопровідною водою та ретельно висушити.

5. Препарат помістити в спирт і знебарвлювати, злегка похитуючи. Ретельно висушити.

6. Дофарбувати одним із додаткових барвників (10 сек).

7. Промити та підсушити препарат.

3. Помилки

3.1 Грампозитивні бактерії забарвилися у червоний колір

Мазок перезнебарвлений (найчастіша помилка)	· Приготувати новий мазок і повторити забарвлення, зменшивши час обробки знебарвлюючим розчином · Переглянути багато полів зору у зіпсованому мазку. Іноді вдається знайти відповідні · Якщо немає можливості приготувати новий мазок, повністю знебарвити наявний, ретельно промити водою, висушити та повторити забарвлення
Стара культура	· Забарвлення за Грамом враховується для добових культур (для бактерій, що повільно ростуть - через дві-три доби). При тривалому зберіганні на живильному середовищі спостерігається дегенарація шару муреїну. Використовуйте культуру відповідного віку
Культура вирощена у несприятливих умовах	· При вирощуванні на селективних середовищах може утворюватися надто тонкий муреїновий шар · Культивуйте мікроорганізм на повноцінному середовищі

3.2 Грамнегативні бактерії пофарбувалися у синій колір

Занадто густий мазок або наявність конгломератів (наприклад, при аутоаглютинації)	· Барвник утримується не клітинною стінкою, а за рахунок капілярності просторів між клітинами у скупченні · Переглянути багато полів зору, можливо в препараті є поля зору з нормальною "густотою" мазка · Повторити приготування препарату, взявши менше культури та приготувавши мазок на більшій площі · При аутоаглютинації культури взяти для приготування мазка дистильовану воду
Мазок погано знебарвлений	· Переглянути багато полів зору, можливо в препараті є поля зору з нормальним знебарвленням · Повторити приготування препарату та його забарвлення · Дознебарвити наявний мазок · Перевірити правильність приготування розчину, що знебарвлює. При повторенні помилки замінити розчин.
Особливості будови клітинної стінки (грамваріабельні бактерії)

Розміщено на Allbest.ru

...

Подібні документи

Особливості будови клітин бактерій, постійні та непостійні компоненти бактеріальної клітини та принципи їх забарвлення за Грамом. Пропіоново-кисле бродіння та способи харчування мікроорганізмів. Санітарна оцінка олії за мікробіологічними показниками.

контрольна робота , доданий 21.10.2010


Визначення призначення та опис механізму гістохімічних методів ідентифікації хімічних речовину гістологічних зрізах. Опис електронної, люмінесцентної та ультрафіолетової мікроскопії. Радіоавтографія та культура клітин та тканин поза організмом.

реферат, доданий 09.09.2014


Техніка приготування гістологічних препаратів для світлової мікроскопії, основні етапи цього процесу та вимоги до умов його реалізації. Методи дослідження у гістології та цитології. Приблизна схема забарвлення препаратів гематоксилін – еозином.

контрольна робота , доданий 08.10.2013


Історія систематичного вивчення закономірностей еволюції тканин. Теорія паралелізму гістологічних структур. Теорія дивергентної еволюції тканин. Теорія філембріогенезу у гістології. Епітеліальна, похідні мезенхіми, м'язова та нервова тканина.

презентація , додано 12.11.2015


Шаруваті кам'яні структури (строматоліти) – результат життєдіяльності бактерій як найдавнішої групи організмів. Вивчення бактерій, форма та будова бактерій, їх розміри та поширення. Класифікація бактерій за способом харчування, розмноження.

презентація , додано 14.10.2011


Методи вивчення морфології мікроорганізмів при мікроскопії препаратів, виготовлених із чистих культур шляхом фарбування. Способи вітального забарвлення мікроорганізмів для запобігання артефактам, що з'являються в результаті токсичної дії барвника.

презентація , доданий 23.02.2016


Поділ водоростей на систематичні групи вищого рангу, його збіг із характером забарвлення та рисами будови. Кліткові оболонки водоростей. Безстатеве та статеве розмноження водоростей. Риси схожості та відмінності жовто-зелених та зелених водоростей.

реферат, доданий 09.06.2011


Живлення бактерій. Способи надходження поживних речовин у клітину. Класифікація бактерій за типами живлення, джерелами енергії та електронами. Пропіоновокисле бродіння, його основні учасники, їхня характеристика, використання в народному господарстві.

контрольна робота , доданий 29.11.2010


Історія та Загальна характеристикагрупи, опис її порід, відмінні особливостіта властивості. Забарвлення собак та принципи її успадкування. Особливості генетики забарвлень та інших селекційно-важливих ознак собак групи "Буль", психічні особливості.

дипломна робота , доданий 20.04.2012


Поняття та механізм функціонування смакової сенсорної системи (смаковий аналізатор, орган смаку). Трансдукція смакового сигналу та основні порушення. Узагальнення агентів, що ушкоджують. Удосконалення методу фарбування метиленовим синім смакових клітин.