otroci

Kako se proizvaja hialuronska kislina? Sestava in uporaba hialuronske kisline v medicini. Glavne vključujejo

1. Zgodovina odkritja

2. Fizikalno-kemijske lastnosti HA

3.Biološka vloga HA

4.Sinteza in presnova HA v človeškem telesu

5. Priprava in modifikacija HA

6. Aktivne biološke funkcije HA v človeškem telesu

7.Uporaba HA v kozmetologiji in plastični kirurgiji

8. Injekcijske tehnike dajanja hialuronske kisline in njihovi zapleti

1. Zgodovina odkritja

Hialuronska kislina(hyaluronate, hyaluronan) (HA) je nesulfoniran glikozaminoglikan, ki je del vezivnega, epitelnega in živčnega tkiva. Je ena glavnih sestavin zunajceličnega matriksa in se nahaja v številnih bioloških tekočinah (steklovini, sinovialni tekočini itd.). Ime "hialuronska kislina" je tej snovi leta 1934 dal K. Meyer. Kemična struktura hialuronske kisline (v petdesetih letih prejšnjega stoletja sta jo ugotovila K. Meyer in J. Palmer, ki sta jo prva identificirala iz steklovine očesa.

2. Fizikalno-kemijske lastnosti HA

Hialuronska kislina je polimer, sestavljen iz ostankov D-glukuronske kisline in D-N-acetilglukozamina, ki so izmenično povezani z β-1,4- in β-1,3-glikozidnimi vezmi. Molekula HA lahko vsebuje do 25,00 takih disaharidnih enot. Naravna HA ima molekulsko maso od 5 do 20.000 kDa, proizvajajo jo tudi nekatere bakterije (npr. Streptococcus) [Murry R. et al., 2009], vendar ne obstaja v prostem stanju, ampak le v obliki soli Na , Ca itd., zato, ko govorimo o HA, vedno mislimo na neko vrsto soli.

3.Biološka vloga HA

Tudi 1% raztopina HA ima opazno viskoznost, saj njene molekule tvorijo nekaj podobnega mreži v vodi. Ni zaman, da se hialuronska kislina včasih imenuje molekularna goba [Signore Jean-Marc, 1998]. Zaradi svojih fizikalno-kemijskih lastnosti (visoka viskoznost, specifična sposobnost vezave vode in beljakovin ter tvorbe proteoglikanskih agregatov) HA prispeva k uresničevanju številnih funkcij vezivnega tkiva in je ena glavnih sestavin zunajceličnega matriksa, steklastega telesa oči in sinovialne tekočine. [Stroitelev V., Fedorishchev I., 2000].

Študije HA so pokazale, da je edinstvenost te snovi tudi v tem, da molekule HA z različnimi dolžinami polisaharidnih verig različno vplivajo na celično obnašanje:

— Kratka veriga HA(z molekulsko maso manj kot 30.000) imajo protivnetni učinek;

— Srednje molekularna HA(z molekulsko maso več kot 500.000) zavira angiogenezo, zavira celično migracijo in proliferacijo ter tvorbo interlevkina-1b in prostaglandina E2, zaradi česar se pogosto uporablja v oftalmologiji in zdravljenju posttravmatskih in degenerativni artritis;

— Visokomolekularna frakcija HA s pomolom s težo 50.000-100.000 ima sposobnost spodbujanja celične migracije in proliferacije v koži ter ima tudi visoko sposobnost zadrževanja vode. Ena molekula visokomolekularne frakcije HA veže do 500 molekul vode. Zato je dermis, ki vsebuje veliko količino HA, optimalno nasičen z vodo, kar koži zagotavlja elastičnost in odpornost na zunanje vplive.

4.Sinteza in presnova HA v človeškem telesu

Za razliko od drugih glikozaminoglikanov, ki se sintetizirajo v Golgijevem aparatu, se GA sintetizira na notranji površini plazemske membrane. Ko se polimerna veriga podaljša, se HA sprosti skozi membrano na njeno zunanjo površino. Zunaj celice lahko HA tvori komplekse s proteini, ki vežejo hialuronat, imenovane hialaterini.

Vsi hialaderini vsebujejo hialuronatni vezavni motiv ali proteoglikansko tandemsko ponovitev (PTR) v eni (CD44 in TSG-6) ali dveh (vernikan, vezavni protein, agrekan, nevrokan, brevikan) kopiji. Različna tkiva vsebujejo različne sklope hialaderinov, kar je posledica strukturnih značilnosti in funkcij specifičnega vezivnega tkiva. Tako so agrekan in vezavni protein našli v hrustancu, verzikan pa v mehkejšem vezivu dermisa.

Sintezo hialuronata izvaja encim hialuronat sintaza. Pri ljudeh obstajajo tri hialuronatne sintaze HAS1, HAS2 in HAS3. Kodirajo jih različni geni, ki se nahajajo na različnih kromosomih in izhajajo iz skupnega prednika. Vsak od sintetiziranih HAS proteinov (hialuronat sintaze) lahko igra specifično vlogo v biosintezi hialuronata:

— HAS1 beljakovine izvaja počasno sintezo hialuronata z visoko molekulsko maso;

— beljakovine HAS2 znatno aktivnejši od HAS1 in sintetizira tudi hialuronat z visoko molekulsko maso (do 2 x 106 Da);

— beljakovine HAS3 najbolj aktiven od treh proteinov HAS, vendar sintetizira krajše hialuronatne verige ((2-3) x 105 Da).

Molekule hialuronata različnih dolžin imajo različne učinke na obnašanje celic. To lahko igra pomembno vlogo v mehanizmih fiziološke regulacije.

HA razgradi skupina tkivnih encimov, imenovanih hialuronidaze. Produkti razgradnje HA (oligosaharidi in hialuronati z izjemno nizko molekulsko maso) kažejo proangiogene lastnosti (spodbujajo tvorbo novih kapilar iz obstoječih žil. Poleg tega so nedavne študije pokazale, da so fragmenti HA, za razliko od naravnega polisaharida z visoko molekulsko maso, sposobni indukcijo vnetnega odziva v makrofagih in dendritičnih celicah za poškodbe tkiva in zavrnitev presajene kože. Telo 70 kg osebe v povprečju vsebuje približno 15 gramov HA, od tega se tretjina vsak dan pretvori (razgradi ali sintetizira).

5. Priprava in modifikacija HA

Za praktične namene v medicini in kozmetologiji se HA izolira iz različnih bioloških tkiv - steklastega telesa živali, sinovialne tekočine, popkovine, membran različnih sevov mikroorganizmov itd. Glavni in najbolj obetaven vir HA so ptičji glavniki.

Enako pomembna naloga je očistiti ekstrakte HA iz tujih beljakovinskih frakcij in nukleinskih kislin ter nato dati zdravilu želene lastnosti tako, da ga spremenimo, da zagotovimo njegove reološke in viskoelastične lastnosti ter povečamo odpornost proti razgradnji pod vplivom telesnih encimov in zunanji dejavniki. Takšna sprememba lastnosti HA širi obseg uporabe kot sestavine različnih zdravil in zdravilnih učinkovin.

Na voljo je en način spreminjanja fotopolimerizacija ali foto-zamreženje molekul hialuronske kisline pod vplivom kvantnega/laserskega sevanja določenih valovnih dolžin od 514 do 790 nm.

6. Biološke funkcije HA v človeškem telesu

Regeneracija: Krepitev migracijske in izločevalne sposobnosti fibroblastov

Protivnetno: Izboljšanje mikrocirkulacije krvi

Protimikrobno: Aktivacija baktericidnih dejavnikov na površini kože in rane

Antitoksično: Zmanjšane stopnje endogene zastrupitve

Imunomodulatorno: Povečana fagocitoza, spremembe v aktivnosti limfocitov

Antioksidant: Sprejemanje reaktivnih kisikovih vrst, blokiranje oksidacije lipidov prostih radikalov

Hemostatik: Aktivacija komponent hemostaze s tvorbo trombov

Zaradi svojih edinstvenih lastnosti se HA kot monoterapija ali v kombinirani sinergiji s kvantno forezo in drugimi fizioterapevtskimi dejavniki (elektroforeza, iontoforeza, magnetna terapija itd.) široko uporablja v programih zdravljenja in rehabilitacije na različnih področjih medicinske prakse in kozmetologije: ortopedije, travmatologije, športne medicine, kirurgije, ginekologije, nevrologije, urologije, dermatologije, estetske medicine itd.

7. Uporaba HA v kozmetologiji in plastični kirurgiji

Prisotnost hialuronske kisline v koži je leta 1948 prvi pokazal K. Meyer. Do sedaj je bilo ugotovljeno, da je koža (tako povrhnjica kot dermis) eno izmed tkiv z najvišjo vsebnostjo hialuronata, ki v veliki meri določa ne le strukturo, temveč tudi zaščitne in regenerativne lastnosti kože.

Hialuronska kislina je naravni vlažilec in ogrodje kože.

V dermisu HA tvori ogrodje, na katerega so pritrjeni drugi glikozaminoglikani (in predvsem hondroitin sulfat) in proteini, imenovani hialaherini zaradi svoje sposobnosti selektivne vezave na HA, da tvorijo polimerno mrežo, ki zapolnjuje večino zunajceličnega prostora in zagotavlja mehansko podporo. za tkiva in hitro difuzijo vodotopnih snovi.molekul in celične migracije. Po drugi strani pa je v povrhnjici HA lokaliziran v pericelularnem prostoru in ustvarja celično membrano, ki jo ščiti pred delovanjem strupenih snovi.

Treba je opozoriti, da ima samo frakcija HA z molekulsko maso 50.000-100.000 sposobnost stimulacije celične migracije in proliferacije v koži ter ima tudi najvišjo možno stopnjo sposobnosti zadrževanja vode. Ena molekula visokomolekularne frakcije HA veže do 500 molekul vode. Zato je koža, ki vsebuje veliko količino HA, maksimalno nasičena z vodo, kar koži zagotavlja elastičnost in odpornost na zunanje vplive.

Eden glavnih znakov staranja kože je zmanjšanje vsebnosti HA in s tem tesno povezano zmanjšanje oskrbe kože z vlago. Največjo količino hialuronske kisline najdemo v vezivnem tkivu novorojenčkov. Do 30-35 let ostane količina HA v dermisu precej stabilna, nato pa se začne precej hitro zmanjševati, kar kažejo znaki biološkega staranja, ki se pojavijo v tem času - izguba vlage, poslabšanje elastičnosti kože. in tonus ter pojav gub.

Poleg tega se s starostjo lastna sinteza hialuronske kisline v dermisu in povrhnjici zmanjša, njeno uničenje pa se pospeši pod vplivom različnih zunanjih in notranjih dejavnikov [Signore Jean-Marc, 1998].

Zaradi svojih edinstvenih lastnosti se HA pogosto uporablja na različnih področjih medicine in kozmetologije.

Trenutno so izjemno priljubljeni posegi, namenjeni pomlajevanju kože obraza, rok in drugih izpostavljenih delov telesa ter odpravljanju vidnih znakov staranja z intradermalnim vbrizgavanjem HA, kar imenujemo hialuronska biorevitalizacija (hialuroplastika), torej povrnitev količine HA v koži, značilni za mladost.

8. Injekcijske tehnike dajanja hialuronske kisline in njihovi zapleti.

Tradicionalna oblika takšne dopolnitve je metoda vbrizgavanja hialuronske kisline v kožo, ki ima številne pomanjkljivosti in zaplete, ki so odvisni od številnih zunanjih in notranjih dejavnikov, vključno s tistimi, ki so povezani z napakami osebja, individualnimi značilnostmi in povečano občutljivostjo kože na alergena narava zdravila, ki vstopa v kri, pa tudi prisotnost sočasnih bolezni in kontraindikacij.

Najpogostejši zapleti pri injiciranju HA so:

- nastajajoče otekline, hude granulomatozne reakcije, različne stopnje edema in eritema na mestih injiciranja zaradi lokalnih preobčutljivostnih reakcij, kot je angioedem, ki lahko trajajo dolgo časa in imajo negativne estetske posledice;

— po injiciranju HA pogosto pride do ponovitve herpetičnih izbruhov zaradi stimulacije latentnega virusa herpesa, zlasti v predelu ustnic;

- uporaba okuženega ali slabo prečiščenega zdravila izzove razvoj nalezljivih kožnih procesov ali reakcij na tujke;

- spremembe pigmentacije kože na območju injiciranja;

- vnetne kožne bolezni na območjih, ki jih je treba zdraviti, onemogočajo injekcijsko biorevitalizacijo - posledice so lahko zelo negativne in izzovejo širjenje vnetnega procesa;

— prisotnost številnih sočasnih bolezni;

— injekcijska biorevitalizacija med nosečnostjo in dojenjem je prav tako nesprejemljiva;

— zapleti po injekcijski biorevitalizaciji so neizogibni, če obstaja alergija na sestavine zdravila ali avtoimunske bolezni;

- jemanje antikoagulantov (zdravil za redčenje krvi, na primer acetilsalicilne kisline v aspirinu) lahko povzroči tudi negativne posledice injekcijske biorevitalizacije;

— če obstaja povečana nagnjenost k nastanku keloidnih brazgotin, injekcijska biorevitalizacija ni priporočljiva, saj so posledice lahko nepredvidljive;

— z manipulacijo igle kozmetolog ne more v celoti nadzorovati podkožja vnosa zdravila in se izogniti vnašanju zdravila v krvno žilo, zlasti v predelu oči. Po drugi strani lahko preveč površinsko vnos zdravila povzroči nastanek neravnih kožnih površin, hkrati pa je pretirano globok vnos lahko neučinkovit;

- boleč postopek;

- ekonomski dejavnik in relativna visoka cena postopka.

Vsem tem negativnim manifestacijam tehnike injiciranja hialuronske kisline se lahko izognemo z uporabo alternativne tehnologije laserske foreze (kvantoforeze) QUANTOL.

Ta tehnika po svoji učinkovitosti v kozmetologiji ni slabša in celo presega še vedno obstoječo in najpogostejšo metodo vbrizgavanja hialuronske kisline v kožo, ki ima številne pomanjkljivosti in zaplete, odvisne od številnih dejavnikov, vključno s tistimi, ki so povezani z napakami osebja, lokalnimi kožni dejavniki, preobčutljivost kože, prisotnost kroničnih bolezni.

S to metodo biorevitalizacije dosežemo veliko bolj voluminozno in enakomerno porazdelitev hialuronske kisline v koži v primerjavi z injekcijskimi metodami.

V bistvu je tehnologija QUANTOLA kombinirana tehnika fotodinamičnega pomlajevanja (biorevitalizacije) kože in pritegne pozornost strokovnjakov zaradi svoje varnosti, učinkovitosti, nebolečnosti, odsotnosti neželenih stranskih učinkov in dostopnosti za široko uporabo.

Širše gledano, poleg namenov pomlajevanja kože, lahko to metodo uspešno uporabljamo za zdravljenje številnih kožnih bolezni, kot so fotopoškodbe kože, hiperplazija žlez lojnic, akne in številna druga stanja, s katerimi se srečujejo dermatologi in kozmetologi itd. (več o tem...)

Podana je kratka zgodovinska skica o odkritju in celoviti študiji hialuronskih kislin. V primerjalnem smislu je bila izvedena sistematizacija podatkov znanstvene literature o značilnostih kemijske zgradbe, fizikalno-kemijskih lastnostih, histološki in citološki pripadnosti, delovanju in metabolizmu hialuronskih kislin v organizmih različnih taksonomskih skupin. Identificirane so značilnosti encimske sestave, ki zagotavljajo sintezo in razgradnjo biopolimera v mikroorganizmih in tkivnih celicah sesalcev. Analizirane so tradicionalne tehnologije za pridobivanje surovin iz živali in metode za njihovo proizvodnjo na osnovi kultur Streptococcus equi subsp. equi, S. equi subsp. zooepidemiсus in Bacillus subtilis. Utemeljen je znanstveni in tehnični razvoj inovativnih biotehnologij hialuronskih kislin različnih molekulskih mas in možnosti za njihovo proizvodnjo. Predstavljene so informacije o uporabi izdelkov na njihovi osnovi na različnih področjih sodobnega življenja.

hialuronska kislina

tehnologije mikrobne sinteze

biotehnologija

bakterije

1. Beloded A.V. Mikrobiološka sinteza in razgradnja hialuronske kisline z bakterijami str. Streptococcus: povzetek. dis. dr. biol. Znanosti: MGUPB - M., 2008. - 23 str.

2. Bychkov S.M., Kolesnikov M.F. Metoda za pridobivanje hialuronske kisline //A. od št. 219752 ZSSR, 1968. - Bilten. št. 19. - Str. 90.

3. Zabnenkova O.V. Intradermalna polnila na osnovi hialuronske kisline. Indikacije za uporabo, možne kombinacije // Plastična kirurgija in kozmetologija: znanstvena in praktična revija, 2010. - št. 1 - str. 101-115. URL: http://www.pscj.ru/upload/iblock/569/11.pdf (datum dostopa: 24.11.2016)

4. Kostina G., Radaeva I. Uporaba hialuronske kisline v medicini in kozmetologiji // Kozmetika in medicina, 1999. - št. 2-3. - strani 53-57.

5. Lupyna T. P., Voloshina E. S. Mikrobiološka metoda za pridobivanje hialuronske kisline in možnosti za njeno uporabo v farmacevtskih izdelkih. Nacionalna univerza za prehrambene tehnologije, Ukrajina. - 2014. - Str. 4.

6. Pripravki Princess filler in Princess volumen pri korekciji starostnih sprememb na obrazu in atrofičnih brazgotin // Injekcijske metode v kozmetologiji, 2013. - št. 2 / http://corneal.ru/events/publications/43/ (datum dostopa: 24.11.2016 )

7. Portugalova V.B., Erzikyan K.L. Hialuronska kislina in njena vloga v življenju organizmov // Napredek v sodobnem času. Biol., 1986. - T. 101, št. 3. - Str. 344-358.

8. Radaeva I.F., Kostina G.A., Zmievsky A.B. Hialuronska kislina: biološka vloga, struktura, sinteza, izolacija, čiščenje in uporaba // Appl. biokem. mikrobiol., 1997. - T. 33, št. 2. - strani 133-137.

9. Ryashentsev V.Yu., Nikolsky S.F., Vainerman E.S. in drugi Metoda za proizvodnjo hialuronske kisline // Patent št. 2017751 RF, 1994. - Bull. št. 15. - str. 75-76.

10. Tolstykh P.I., Stekolnikov L.I., Ryltsev V.V. in drugi Zdravila živalskega izvora za zunanjo uporabo // Chem.-Pharm. zhurn., 1991. - T. 25, št. 4. - Str. 83-87

11. Polnila: kaj je to [Elektronski vir] // Zobozdravstvo in kozmetologija http://24stoma.ru/filleri.html (datum dostopa: 24. november 2016)

12. Abatangelo G., Martinelli M., Vecchia P. Celjenje ran, obogatenih s hialuronsko kislino: histološka opazovanja // J. Surg. Res., 1983. - V. 35, št. 5. - Str. 410-416.

13. Ahmet Tezel & Clenn H. Fredrickon Dermalna polnila na osnovi hialuronske kisline: pogled z znanstvene perspektive [Univerza v Kaliforniji, Santa Barbara, ZDA] [Elektronski vir] // ESTETIKA KOŽE http://estetika.uz/upload/ files/.pdf (datum dostopa: 24.11.2016)

14. Carter G.R. Pastereloza: Pasteurella multocida in Pasteurella hemolytica. // Adv. vet. Sci., 1967. - V. 11. - Str. 321-379.

15. DeAngelis P.L., Jing W., Graves M.V., Burbank D.E., van Etten J.L. Hialuronan sintaza virusa klorele PBCV-1 // Science, 1997. - V. 278. - P. 1800-1803.

16. DeAngelis P.L., Papaconstantinou J., Weigel P.H. Izolacija genskega lokusa Streptococcus pyogenes, ki usmerja biosintezo hialuronana v akapsularnih mutantih in v heterolognih bakterijah // J. Biol. Chem, 1993. - V. 268. - P. 14568-14571.

17. Frost G.I., Csoka T., Stern R. Hialuronidaze: kemijski, biološki in klinični pregled // Trends Glycosci. Glycotech., 1996. - V. 8. - P. 419-434.

18. Graves M.V., Burbank D.E., Roth R., Heuser J., DeAngelis P.L., van Etten J.L. Sinteza hialuronana v zelenih algah, podobnih kloreli, okuženih z virusom PBCV-1 // Virologija, 1999. - V. 257. - P.15-23.

19. Karlstam V., Vincent J., Johansson V., Bryno C. Preprosta metoda čiščenja stisnjenega krila za pridobivanje visokih ravni hidrolitičnih encimov // Prep. Biochem., 1991. - V. 21. - P. 237-256.

20. Kendall F.E., Heidelberger M., Dawson M.H. Serološko neaktiven polisaharid, ki ga tvorijo mukoidni sevi hemolitičnega streptokoka skupine A. // J. Biol. Chem., 1937. - V. 118. - Str. 61-69.

21. Kim J.H., Yoo S.J., Oh D.K., Kweon Y.G. et al. Izbira Streptococcus equi mutanta in optimizacija pogojev kulture za proizvodnjo visokomolekularne hialuronske kisline. // Enzyme Microb. Technol., 1996. - V. 19. - Str. 440-445.

22. Lansing M., Lellig S., Mausolf A., Martini I., Crescenzi F., Oregon M., Prehm P. Hyaluronate synthase: kloniranje in sekvenciranje gena iz Streptococcus sp. // Biochem. J., 1993. -V. 289. - Str. 179-184.

23. Linker A., Meyer K. Proizvodnja nenasičenih uronidov z bakterijskimi hialuronidazami // Narava, 1954. - V. 174. - Str. 1192-1194.

24. Matsubara C, Kajiwara M., Akasaka H., Haze S. Študije jedrske magnetne resonance Carbon-13 o biosintezi hialuronske kisline // Chem. Pharm. Bull., 1991. - V. 39. - Str. 2446-2448.

25. Meyer K. Visoko viskozen natrijev hialuronat // J. Biol. Chem., 1948. - V. 176. - Št. 2. - Str. 993-997.

26. Meyer K. Hialuronidaze // Encimi. - V. 5. / ur. Boyer P.D. - New York: Academic Press, 1971. - Str. 307-320.

27. Meyer K., Palmer J. Polisaharid steklovine // J. Biol. Chem., 1934. -V. 107. - Str. 629-634.

28. Mortimer E.A., Vastine E.L. Proizvodnja kapsularnega polisaharida (hialuronske kisline) s kolonijami L streptokokov skupine A. // J. Bacteriol., 1967. - V. 94, št. 1. - Str. 268-271.

29. Prehm P. Hialuronan. // Biopolimeri: biologija, kemija, biotehnologija, aplikacije. -V. 5: Polisaharidi I. Polisaharidi iz prokariontov. /ur. Vandamme E.J., DeBaets S., Steinbuchel A. - Weinheim: Wiley-VCH, 2000. - Str. 379-404.

30. Prehm P. Sinteza hialuronata v diferenciranih celicah teratokarcinoma: karakterizacija sintaze. // Biochem. J., 1983. - V. 211. - Str. 181-189.

31. Roseman S., Moses F.E., Ludowieg J., Dorfman A. Biosinteza hialuronske kisline s Streptococcusom skupine A. Uporaba l-C14-glukoze // J. Biol. Chem., 1953. - V. 203. - P.213-225.

32. Scott J.E., Cummings C, Brass A., Chen Y. Sekundarne in terciarne strukture hialuronana v vodni raztopini, raziskane z rotacijsko senčno elektronsko mikroskopijo in računalniško simulacijo. Hialuronan je zelo učinkovit polimer, ki tvori mrežo // Biochem. J., 1991. - V.274. - Str. 699-705.

33. Shimada E., Matsumura G.J. Molekulska teža hialuronske kisline iz kunčje kože //J. Biochem., 1977. - V. 81. - Št. l. - Str. 79-91.

34. Stern R., Asari A.A., Sugahara K.N. Fragmenti hialurona: informacijsko bogat sistem // Eur. J. Cell Biol., 2006. - V. 85. - Str. 699-715.

35. Sugahara K., Schwartz N.B., Dorfman A. Biosinteza hialuronske kisline s Streptococcus // J. Biol. Chem., 1979. - V. 254, št. 14. - Str. 6252-6261.

36. Weigel P.H., Hascall V.C., Tammi M. Hyaluronan Synthases // J. Biol. Chem., 1997. - V. 272, št. 22. - Str. 13997-14000.

37. Widner B., Behr R., Von Dollen S., Tang M., Nei T., Sloma A., Sternberg D., DeAngelis P.L., Weigel P.H., Brown S. Proizvodnja hialuronske kisline pri Bacillus subtilis // Appl. Okolje. Microbiol., 2005. - V. 71, št. 7. - Str. 3747-3752.

OPIS RAZLIČNIH METOD ZA PRIDOBIVANJE HIALURONSKE KISLINE

Savoskin O. V. 1 Semyonova E. F. 1 Rashevskaya E. Yu. 1 Polyakova A. A. 1 Grybkova E. A. 1 Agabalaeva K. O. 1 Moiseeva I. Ya. 1

1 Državna univerza Penza

Povzetek:

Članek podaja kratek zgodovinski oris odkritja in celovite študije hialuronskih kislin. Primerjamo in sistematiziramo znanstvene članke, ki se osredotočajo na posebnosti delovanja, metabolizma, kemijske zgradbe, fizikalnih, kemijskih, histoloških in citoloških lastnosti hialuronske kisline v organizmih različnih taksonomskih skupin. Razkrivamo tudi posebnosti encimske sestave, ki zagotavljajo sintezo in razgradnjo biopolimerov v mikroorganizmih in celicah tkiv sesalcev. Poleg tega analiziramo tradicionalne tehnologije pridobivanja surovin živalskega izvora in načine njihovega pridobivanja iz Streptococcus equi subsp. equi, S. equi subsp. zooepidemiсus in Bacillus subtilis. Poleg tega predstavljamo podlage za znanstveni in tehnični razvoj inovativnih biotehnologij, povezanih s hialuronskimi kislinami z različno molekulsko maso, in možnosti njihove proizvodnje. Na koncu podajamo informacije o tem, kako se izdelki na osnovi hialuronske kisline uporabljajo na različnih področjih sodobnega življenja.

Ključne besede:

tehnologije mikrobne sinteze

V zadnjih letih so medicina, farmacija in kozmetologija močno napredovale pri uporabi spojin z visoko molekulsko maso (HMC) kot glavnih učinkovin, pa tudi kot pomožnih, korektivnih snovi in polnil. Eden najbolj priljubljenih IUD v medicini in kozmetologiji danes je hialuronska kislina (HA), ki je našla svojo uporabo v kirurgiji kot nadomestek sinovialne tekočine v sklepih kot mazalna in hondroprotektivna komponenta; dermatologija, kot sredstvo za remodeliranje pri korekciji starostnih deformacij kože obraza, predvsem kože okoli oči; ginekologije, kot sredstvo proti adhezijam za intravaginalne adhezije. Tako je spekter uporabe hialuronske kisline zelo širok; nenehno se dopolnjuje, kar vodi do povečanja povpraševanja po tej vrsti biopolimera in posledično zanimanja za alternativne vire njegove proizvodnje.

1. Zgodovina odkritja hialuronske kisline

Leta 1934 je bil v Journal of Biological Chemistry objavljen članek Karla Mayerja in Johna Palmerja, ki omenja nenavaden polisaharid, izoliran iz steklastega telesa bikovega očesa (iz grškega hyalos - steklast in angleškega uronic acid - uronska kislina), precej visoka molekulska masa 450 g/mol in brez sulfatnih skupin. Nadaljnje študije so pokazale, da polisaharid predstavljajo fragmenti disaharida, ki je sestavljen iz D-glukuronske kisline in N-acetiliranega glukozamina.

Podatki o pripadnosti biopolimera samo strukturam organizmov sesalcev so bili ovrženi, ko sta leta 1937 Kendal in Heidelberger objavila izolacijo polisaharida, identičnega hialuronanu, iz tekočine kulture hemolitičnega streptokoka. Identiteto izoliranega biopolimera so potrdili pozneje po ugotovitvi strukture polisaharida v 60. letih. Leta 1954 je vodja laboratorija Meyer v reviji Nature objavil strukturno formulo disaharidnega fragmenta, produkta cepitve s streptokokno hialuronat liazo.

Znanstveno zanimanje za hialuronsko kislino, njeno proizvodnjo, izolacijo in uporabo je vedno večje. Doslej je bilo v tujih in domačih revijah objavljenih več kot 15.000 člankov. Rezultat raziskave je bil prejem zanesljivih podatkov o izolaciji hialurona iz različnih organov sesalcev, pa tudi iz kultur različnih celic (hemolitični streptokok, streptomicete, korinebakterije). Nekateri podatki so imeli industrijski pomen, na primer ekstrakcija hialuronske kisline iz kokošjih glavnikov se uporablja še danes. V pol stoletja se je razširil tudi obseg uporabe hialurona (kirurgija, kozmetologija, travmatologija in ortopedija, dermatologija itd.), Ustvarjene so bile najnovejše dozirne oblike na osnovi njegove polimerne strukture. Vse to ni bilo mogoče brez ugotovitve biološke vloge biopolimera, ki je, kot se je izkazalo, služil kot sestavni del celičnega matriksa, potrebnega za normalno izvajanje presnovnih procesov proliferacije in diferenciacije tkiv. Tako so preučevali proces presnove hialurona v človeškem telesu. Znano je, da se na dan razgradi in sintetizira približno 5 g hialuronske kisline, njena vsebnost v človeškem telesu pa je približno 0,007%, kar je približno 15 g pri ženski, ki tehta 70 kg.

Leta 1953 so Roseman, Moses in Dorfman objavili dela, ki so pokazala metodo za pridobivanje hialurona, njegovo obarjanje in izolacijo v prosti obliki na osnovi kultur hemolitičnega streptokoka. Njihove metode izolacije in obarjanja sta pozneje izboljšala Zifonelli in Maedo, kar je povečalo donos in čistost produkta. Mehanizem tvorbe hialurona v bakterijah, vključno s streptokoki, je bil razkrit pozneje, ko so preučevali encimsko sestavo mikroorganizmov, ki so sposobni sintetizirati hialuronsko kislino. Leta 1959 je bil dokazan obstoj specifičnih peptidov hialuronske sintetaze, ki izvajajo sintezo polisaharidov v bakterijskih membranah.

Leta 1992 so ameriški znanstveniki napovedali kloniranje gena, odgovornega za sintezo hialuronan sintetaze, in njegov prenos v sev Escherichia coli. Vendar pa niso mogli dobiti aktivnega encima. DeAngelis je leta 2002 poročal o uspešni izolaciji operona hialuronat sintetaze in njegovem izražanju v mikroorganizmu. To je bil prvi primer kloniranja glikozaminoglikanskih sintetaz v svetovni praksi.

Trenutno po svetu potekajo raziskave o mehanizmih delovanja hialuronskih kislin, njihovi vlogi v človeškem telesu in alternativnih načinih uporabe. Vendar pa so vprašanja mikrobne sinteze hialurona še posebej pomembna, kar dokazuje cena za kilogram prečiščenega izdelka, ki znaša približno 700.000 tisoč rubljev. (uvožen izdelek na osnovi živalskih surovin). Tako je bilo v zadnjih 20 letih v svetu izdanih več kot 50 patentov, kar kaže na veliko zanimanje za obravnavano problematiko.

2. Kemijska struktura in fizikalne lastnosti hialuronske kisline

Laboratorij Meyer je potreboval približno 20 let od prve objave odkritja živalskega polisaharida hialuronske kisline (1934), da je ugotovil natančno kemijsko strukturo hialuronske kisline. Hialuronska kislina, hialuronat ali hialuronan - (C14H21NO11)n je organska spojina, ki spada v skupino nesulfatiranih glikozaminoglikanov (slika 1). Prisotnost številnih sulfatiranih skupin v sorodnih glikozaminoglikanih je vzrok za številne izomerije, ki jih ni opaziti pri hialuronski kislini, ki je vedno kemijsko enaka, ne glede na načine in vire proizvodnje. Molekula hialuronske kisline je zgrajena iz ponavljajočih se fragmentov D-glukuronske kisline in N-acetil-D-glukozamina, povezanih z β-(1-3) glikozidno vezjo. Hrbtenica sladkornih fragmentov je glukopiranozni obroč z različnimi substituenti (acetamidna skupina, hidroksilne in karboksilne funkcionalne skupine).

riž. 1. Kemijska formula hialuronske kisline

Za molekulo hialuronske kisline je značilna tvorba velikega števila vodikovih vezi tako znotraj molekule kot med sosednjimi ostanki ogljikovih hidratov, ki se nahajajo na precejšnji razdalji drug od drugega, v vodni raztopini pa tudi med sosednjimi molekulami prek karboksilnih in acetamidnih skupin. Ima kislo reakcijo zaradi prisotnosti neprotonirane karboksilne skupine. Kisle lastnosti hialuronata omogočajo pridobivanje vodotopnih soli z alkalijskimi kovinami. Hialuronska kislina je anionski linearni polisaharid z različno molekulsko maso 105-107 Da. Molekulska masa je odvisna od načina izdelave, zaradi odsotnosti izomerije pa je nastali hialuronat vedno kemično enak standardnemu.

Raztopine hialuronske kisline 1-4% tvorijo psevdogele. V vodnem okolju je jakost kislosti karboksilne skupine (pK) približno 3-4, zato je za ohranitev električne nevtralnosti v raztopini molekula obdana s pozitivno nabitimi kovinskimi kationi Na+, K+, Mg2+ in Ca2+, kar vodi do tvorbe močne strukture gela z visoko vsebnostjo vode. S težkimi kovinami in barvili tvori v vodi netopne komplekse. Poleg tega hialuronat specifično reagira z beljakovinami in nam posledično daje kompleksne gelaste komplekse, ki se pogosto oborijo.

V vodni raztopini ima hialuronska kislina precej veliko vzdolžno velikost polisaharidne verige - približno 1 nm, zato ima hialuronska kislina v telesu sesalcev najbolj kompaktno obliko. Z rentgensko difrakcijsko analizo je bilo ugotovljeno, da lahko hialuronat tvori levosučne enojne in dvojne vijačnice, različne večverižne ploščate strukture, pa tudi superzvite strukture z različnimi koncentracijami v različnih delih verige, ki tvorijo gosto molekularno mrežo. , ki predstavlja sekundarno strukturo polisaharida. To je predvsem posledica tvorbe vodikovih vezi, vezave na katione alkalijskih kovin in hidrofobnih interakcij. Terciarna struktura hialuronske kisline je mreža z visokimi reološkimi lastnostmi (domene se odbijajo), sposobna absorbirati znatne količine vode in elektrolitov ter velike proteinske molekule, vendar terciarna struktura ne tvori točno določene velikosti por. Mreže imajo zelo jasno urejenost zaradi prisotnosti elektronskih učinkov po funkcionalnih skupinah in substituentih. V tem primeru molekula zavzame energijsko najugodnejši položaj, ki je odvisen tudi od ionskega okolja.

3. Hialuronska kislina v naravi, funkcije hialuronata v odvisnosti od histološke in citološke pripadnosti v različnih organizmih.

Prisotnost hialuronat sintetaz in hialuronske kisline v kapsulah virusov in bakterij iz rodu Streptococcus je mogoče razložiti kot adaptivno evolucijsko prilagoditev, ki so si jo bakterije in virusi izposodili od višjih živali, s čimer so povečali svojo sposobnost premagovanja gostiteljevega imunskega odziva.

3.1 Hialuronska kislina v tkivih sesalcev

Hialuronat je glavna sestavina medceličnega matriksa različnih tkiv sesalcev, vendar je neenakomerno porazdeljen. Na primer, največjo koncentracijo hialuronske kisline v človeškem telesu opazimo v sinovialni tekočini, popkovini, steklastem telesu očesa in koži.

V koži se glikozaminoglikan nahaja v intersticijskem prostoru in opravlja številne funkcije: zadržuje vodo, s čimer ohranja naravno elastičnost in volumen kože, kar je tako pomembno pri vnetnih reakcijah; sodeluje pri procesih proliferacije in diferenciacije keratinocitov in imunokompetentnih celic, s čimer ima vlogo pri vzdrževanju normalnega procesa rasti in regeneracije kože ter izvajanju lokalne imunosti, krepi kolagenska vlakna (slika 2); Služi kot naravna pregrada, ki ščiti pred prostimi radikali, patogeni in kemikalijami.

riž. 2. Vpliv hialuronske kisline na kolagenska vlakna.

Ob pomanjkanju naravne hialuronske kisline, na primer pri staranju ali kožnih boleznih, se razvijejo degenerativne motnje: zmanjša se lokalna imunost, sposobnost celjenja ran, zmanjša se elastičnost kože, kar povzroči nastanek gub. V hrustančnem tkivu HA deluje kot strukturni element matriksa, ki je potreben za vezavo in zadrževanje proteoglikana hondroitin sulfata za krepitev kolagenskega ogrodja hrustanca. V sinovialni tekočini hialuronat zagotavlja mazanje gibljivih delov sklepa, kar zmanjšuje obrabo in trganje. Pri vnetnih boleznih sklepov (artritis) se zmanjša količina hialuronske kisline, zmanjša se viskoznost sinovialne tekočine, kar vodi do poslabšanja gibljivosti. Hialuronska kislina ima tudi pomembno vlogo pri embriogenezi in je prenašalec signalov za celično gibljivost.

Tako so funkcije hialuronata zelo obsežne in z nadaljnjim širjenjem obsega proučevanja njegovih lastnosti bo odkritih vse več novih dejstev o vlogi glikozaminoglikana v telesu človeka in sesalcev.

3.2 Hialuronska kislina kot sestavina bakterijskih kapsul

4. Presnova hialuronske kisline

Sinteza hialuronske kisline je precej dobro raziskana. Pri sesalcih in bakterijah iz rodov Streptococcus in Pasteurella biokemija procesa ni bistveno drugačna. Sinteza hialuronske kisline zahteva polimerne komponente: glukuronsko kislino in N-acetilglukozamin. Glukuronska kislina se sintetizira s serijo encimskih reakcij iz glukoza-6-fosfata (slika 3).

riž. 3. Shema sinteze glikozaminoglikanov

Glukoza-6-fosfat se izomerizira v glukoza-1-fosfat z encimom α-fosfoglukomutazo. Nato encim UDP-glukoza pirofosforilaza katalizira tvorbo UDP-glukoze iz uridin difosfata in glukoze. Nato pride do encimsko odvisne oksidacije hidroksilnih skupin UDP-glukoze pod delovanjem encima UDP-glukoza dehidrogenaze. Rezultat je tvorba glukuronske kisline.

N-acetilglukozamin se sintetizira iz fruktozo-6-fosfata. Med biosintezo aminosladkorjev se amino skupina prenese na fruktozo-6-fosfat. Donor amino skupine je glutamin, encim amidotransferaza. Rezultat je tvorba glukozamin-6-fosfata, ki ga mutaza izomerizira v glukozamin-1-fosfat, ki se acetilira s sodelovanjem encima acetiltransferaze v prisotnosti CoA v N-acetilglukozamin-1-fosfat, ki mora se aktivira s pirofosforilazo v UDP-N-acetilglukozamin-1-fosfat. To je proces, ki porablja energijo.

Zadnji korak v sintezi hialuronske kisline je izvedba glikozid transferazne reakcije z uporabo enega samega encima, hialuronat sintetaze. Ta proces poteka tudi s porabo energije ATP (2 mola ATP se porabita za sintezo 1 mola hialuronata).

4.1. Hialuronske sintetaze: struktura, funkcije, lokalizacija, kinetične značilnosti in mehanizmi katalize

Hialuronan sintetaza je 49 kDa metaloprotein, encim, ki potrebuje kovinske katione za koordinacijo s fosfatnimi skupinami (aktivacija) in uporablja glukozidne fosfate kot substrate. Je edini tovrstni encim, ki katalizira sintezo hialuronske kisline v telesu sesalcev in v celični steni hemolitičnega streptokoka ter v virusu PBCV-1 in bakteriji Pasteurella multicida. Raziskave, opravljene v petdesetih letih prejšnjega stoletja v laboratoriju Meyer, so omogočile ugotovitev značilnih lastnosti encima hialuronat sintetaze: deluje pri nevtralnih pH vrednostih, za katalizo potrebuje glukuronsko kislino in N-acetilglukozamin, aktiviran s konjugacijo z uridin difosfatom, kot prisotnost kationov Mg2+ in Mn2+ za koordinacijo fosfatnih skupin. Encim kaže visoko aktivnost v prisotnosti kardiopina (ki se nahaja v kompleksu). Tip 1 sta v letih 1983-1998 proučevala Prehm in Asplund, značilen za hemolitične streptokoke sesalcev: hialuronat sintetaza sintetizira hialuronsko kislino tako, da veže ogljikove ostanke na redukcijski konec hialuronata, pri čemer se izmenjujejo β(1-3) in (1-4) glikozidne vezi. .

4.2. Encimi, ki depolimerizirajo hialuronsko kislino

Katabolne reakcije hialuronske kisline temeljijo na encimski katalizi s pomočjo encimov hialuronske kisline. Hialuronatne liaze je leta 1971 razvrstil Meyerjev laboratorij. Koncept te klasifikacije je izjemno preprost: encim – katalizirana reakcija – reakcijski produkt. V skladu s to klasifikacijo ločimo tri različne vrste hialuronidaz (hialuronat liaze):

Hialuronoglukozaminidaze (hialuronidaze sesalcev) - endo-β-N-acetilheksoamidinaze, razgrajujejo hialuronsko kislino na tetra- in heksasaharide.

Hialuronoglukozaminidaze nimajo substratne specifičnosti in so tudi sposobne tvoriti navzkrižne povezave med molekulami hialuronata in hondroitin sulfata. Ena od dodatnih funkcij hialuronidaz pri sesalcih je razgradnja hialuronata v disaharide za pridobivanje energije.

Hialuronatne liaze (bakterijske hialuronidaze) so endo-β-acetil-heksoaminoeliminaze, ki hidrolizirajo hialuronat v 4,5-nenasičene disaharide. Imajo visoko substratno specifičnost. Pri bakterijah so hialuronidaze dejavnik patogenosti, potreben za invazijo in adhezijo bakterij (za prodor v telo sesalca).

5. Pridobivanje hialuronske kisline

Vse znane metode pridobivanja hialuronske kisline lahko razdelimo v dve skupini: fizikalno-kemijska metoda, ki je sestavljena iz ekstrakcije hialuronata iz živalskih tkiv sesalcev, drugih vretenčarjev in ptic; in mikrobna metoda za proizvodnjo HA, ki temelji na proizvodnji bakterij.

5.1. Fizikalno-kemijska metoda: ekstrakcija iz živalskih surovin

Kot smo že omenili, se hialuronska kislina nahaja v številnih tkivih sesalcev in ptic in glede na histologijo se lahko vsebnost hialuronske kisline in njena molekulska masa spreminjata. Poleg tega lahko hialuronat v različnih tkivih kompleksira z beljakovinami in sorodnimi polisaharidi, kar oteži njegovo čiščenje in kasnejšo izolacijo. Trenutno se za industrijsko proizvodnjo uporabljajo popkovine novorojenčkov in piščančji glavniki. Vendar pa so poleg zgoraj navedenih metod opisane različne metode za izolacijo hialuronata na podlagi steklastega telesa govejih oči, sinovialne tekočine, sklepnih ovojnic, kože prašičev, krvne plazme in hrustančnega tkiva. Pri izolaciji biopolimera se uporabljajo različne metode izolacije: homogenizacija, ekstrakcija, frakcijsko obarjanje itd.

Vsak postopek za izolacijo hialurona vključuje predhodno uničenje organov in tkiv, ki vsebujejo biopolimerne in beljakovinsko-ogljikove hidratne komplekse. Uničenje se doseže s tehnikami mletja in homogenizacije. Nastali homogenat nato izpostavimo ekstrakciji z uporabo vodnih organskih topil. Kovalentno vezane peptidne nečistoče odstranimo z encimsko proteolizo, obdelavo s proteazami (papain) ali kemično denaturacijo (kloroform, amilni alkohol z etanolom). Naslednja faza je adsorpcija na aktivnem oglju z elektrodializo. Biopolimer očistimo mukopolisaharidnih nečistoč z obarjanjem s cetirpiridinijevim kloridom ali z ionsko izmenjevalno kromatografijo.

Najbolj razširjena metoda je zaradi dostopnosti surovin in visoke vsebnosti biopolimerov metoda izolacije hialuronske kisline iz petelinjega glavnika. Ekstrakcijo izvedemo z mešanico acetona in kloroforma (odstranitev beljakovin), vodo ali mešanico vode in alkohola (propionski, tert-butilni alkoholi), čemur sledi sorpcija na aktivnem oglju, z elektroforezo ali na ionsko izmenjevalni smoli.

5.2. Mikrobna sinteza, proizvajalci hialuronske kisline

Metoda mikrobne sinteze hialuronske kisline na osnovi sevov bakterij, ki proizvajajo, je ekonomsko bolj donosna. Takšna sinteza bo imela ob uvedbi v velikoserijsko proizvodnjo manj stroškov, kot so stroški živalskih surovin in odvisnost od sezonskih zalog. Nasprotno, proizvodnja hialurona na osnovi mikrobne sinteze bo omogočila povečanje proizvodnje in pridobitev visoko prečiščenega izdelka, ki ne vsebuje nečistoč in ima zato nizko alergenost. Od odkritja sposobnosti bakterij za sintezo hialuronske kisline potekajo raziskave možnosti pridobivanja želenega polimera biotehnološko, to je z gojenjem bakterij proizvajalk v hranilnih gojiščih določene sestave pod strogo določenimi pogoji, ki jim sledi izolacija tarče. izdelek. Proizvajalci hialurona so bakterije iz rodov Streptococcus in Pasteurella, ki tvorijo kapsule. Obstajajo številne zahteve za proizvodnjo sevov:

Pomanjkanje patogenosti in zlasti hemolitične aktivnosti;

Sposobnost sintetiziranja hialuronske kisline z visoko molekulsko maso;

Velike velikosti kapsul z visoko vsebnostjo biopolimera (kapsule je treba zlahka ločiti, po možnosti med ekstrakcijo);

Pomanjkanje aktivnosti hialuronidaze za odpravo izgube ciljnega produkta;

Visoka rastna zmogljivost z najbolj popolno uporabo substrata;

Ohranjanje stabilnosti fizioloških in biokemičnih lastnosti.

Raziskava, da bi našli sev, ki bi lahko zadostil zahtevam biopolimerov in izpolnjeval vse parametre, je vodila do Streptococcus equi surbsp. equi. in Streptococcus equi surbsp. zooepidemija.

Divje vrste streptokokov sintetizirajo zunajcelične beljakovine, kar zmanjša izkoristek biopolimera. Zato so bili za pridobitev reproduktivnih hialuronidaza-negativnih, nehemolitičnih sevov spremenjeni s kemično in UV-inducirano mutagenezo ali neusmerjeno mutagenezo, ki ji je sledila selekcija. Gensko spremenjeni sevi bakterije Escherichia coli, pridobljeni na podlagi metod izražanja operonov, ki kodirajo sintezo streptokokne hialuronat sintetaze na bakterijski matriksu, trenutno niso v uporabi zaradi nizkega izkoristka biopolimera. Izjema se lahko šteje za gensko spremenjeni sev Bacillus subtilis, ki kaže visoke donose biopolimera pri gojenju na kompleksnih fermentiranih medijih.

Biotehnologija mikrobne sinteze hialuronske kisline na osnovi sevov Streptococcus zooepidemicus. Spodaj je podana tipična sestava sintetičnega hranilnega medija za bakterije iz rodu Streptococcus, ki sintetizirajo hialuronsko kislino.

Vir ogljikovih hidratov in energije: glukoza - 1000; aminokisline: DL-alanin, L-arginin, L-asparaginska kislina, L-cistin, L-cistein, L-glutaminska kislina, L-glutamin, L-glicin, L-histidin, L-izolevcin, L-levcin, L - lizin, L-metionin, L-fenilalanin, hidroksi-L-prolin, L-serin, L-treonin, L-triptofan, L-tirozin, L-valin po 100; vitamini: biotin - 0,2, folna kislina - 0,8, nikotinamid - 1, nikotinamid adenin dinukleotid - 2,5, kalcijev pantotenat - 2, piridoksal - 1, piridoksamin hidroklorid - 1, riboflavin - 2, tiamin hidroklorid - 1; nukleotidi: adenin - 20, gvanin hidroklorid - 20, uracil - 20; soli organskih in anorganskih kislin: FeS04*7H20 - 5, Fe(N03)2*9H20 - 1, K2НР04 - 200, KН2Р04 - 1000, MgS04*7H20 - 700, MnS04 - 5, CaС12*6Н20 - 10, NaC2H302*3H2O - 4500, NaHC03 - 2500, NaH2P04*H20 - 3195, Na2HP04 - 7350.

Gojenje bakterij iz rodu Streptococcus za pridobivanje HA običajno poteka v šaržnih pogojih. Hranilni medij pripravimo enkrat z raztapljanjem potrebnih sestavin gojišča v vodi, nato pa gojišče steriliziramo. Vir ogljika se sterilizira ločeno. Po zasejanju napredek fermentacije spremljamo s porabo substrata, povečanjem koncentracije celic, tvorbo produkta (HA), presnovnimi produkti in spremembami pH okolja. Največja koncentracija HA je približno 5 g/l. Nadaljnje povečanje vsebnosti HA v mediju povzroči večkratno povečanje viskoznosti CL, močno poslabšanje lastnosti prenosa mase v procesu fermentacije in težave pri prezračevanju in mešanju. Koncentracija HA med periodično ali periodično fermentacijo s hranjenjem na substratu doseže določeno vrednost v 6 - 26 urah. Ko kultura preide v stacionarno fazo, je praviloma proces končan. Celice mikroorganizmov inaktiviramo s segrevanjem na 60 - 80 °C. Biomaso ločimo po eni od znanih metod – flokulacija, separacija, centrifugiranje, filtracija. HA iz CL se obori z organskimi topili ali kationskimi površinsko aktivnimi snovmi. Čiščenje poteka z metodami ultrafiltracije, ponovnega obarjanja ali kromatografije.

Te metode se bistveno ne razlikujejo od prej opisanih metod za izolacijo HA iz živalskih surovin. Na primer, patent za metodo za proizvodnjo HA opisuje naslednjo metodo za gojenje seva proizvajalca in izolacijo HA. Fermentacijo smo izvajali v 3-litrskem bioreaktorju (faktor polnjenja fermentorja 0,5) v mediju s sestavo: 2,0 % glukoze, 0,5 % DE, 1,5 % peptona, 0,3 % KH2P04, 0,2 % K2HP04, 0,011 % Na2S203, 0,01 % MgS04. * 7H20, 0,002 % Na2S03, 0,001 % CoC12, 0,001 % MnCl2 in 0,5 % sojinega olja; pH medija je 7,0. Sterilizacijo medija smo izvajali s tiho paro pri 120 °C 15 minut. Po ohladitvi na sobno temperaturo smo dodali inokulum seva kulture S. zooepidemicus Ferm BP-878 v količini 0,1 l. Aerobna kultivacija (pretok zraka 0,7 l/(l*min) je trajala 26 ur s konstantnim nadzorom temperature (35 °C) in mešanjem gojišča (300 vrt./min). pH gojišča smo vzdrževali konstantno pri 7,0. 24. uro kultivacije v aseptičnih pogojih smo substrat hranili s 100 ml 50% raztopine glukoze. Postopek smo zaključili po 26 urah kultivacije.

Za izolacijo HA so bili izvedeni naslednji postopki. Bakterijski kulturi smo dodali 3,2 L destilirane vode. Po temeljitem in dolgotrajnem mešanju smo biomaso ločili s centrifugiranjem. Supernatant smo koncentrirali na 1,6 L z uporabo aparata za ultrafiltracijo z votlimi vlakni in dializirali proti destilirani vodi. Nastali raztopini smo dodali natrijev acetat do končne koncentracije 0,5 % in izvedli obarjanje 5 litrov etilnega alkohola. Polisaharidno oborino smo ločili s centrifugiranjem. Čiščenje HA smo izvedli tako, da smo nastalo oborino raztopili v destilirani vodi (0,5 l) in dodali 4 % vodno raztopino cetilpiridinijevega bromida. Oborino HA, vezano na kationsko površinsko aktivno snov, smo ločili in raztopili v 40 ml 0,3 M raztopine natrijevega klorida. Neraztopljeni del usedline smo zavrgli. Raztopini dodamo 120 ml etanola, da oborimo HA. Oborino smo ločili in raztopili v destilirani vodi, nato pa smo izvedli čiščenje na ionski izmenjevalni smoli in ponovno alkoholno obarjanje. Dobitek očiščenega natrijevega hialuronata iz ene fermentacije je bil 7,8 g, vsebnost beljakovin v pripravku je bila manjša od 0,05%. Molekulska masa HA je bila 1,005 MDa.

Druge metode biotehnološke proizvodnje HA, opisane v patentih, se nekoliko razlikujejo v sestavi gojišč.

Biotehnologija mikrobne sinteze hialuronske kisline na osnovi bakterijskih sevov Bacillus subtilis. Metode za proizvodnjo hialuronske kisline vključujejo metodo biosinteze HA na osnovi gensko spremenjenega seva Bacillus subtilis, ki vsebuje genetski konstrukt, vključno s promotorjem, ki je funkcionalno aktiven v določeni celici, in kodirno regijo, sestavljeno iz nukleotidnega zaporedja, ki kodira streptokokno hialuronansko sintazo (ima); zaporedje, ki kodira Bacillus UDP-glukoza-6-dehidrogenazo (tuaD) ali podoben encim streptokoknega izvora (hasB), in zaporedje, ki kodira bakterijsko ali streptokokno UDP-glukoza pirofosforilazo.

Metoda vključuje gojenje gostiteljske celice Bacillus pod pogoji, primernimi za proizvodnjo hialuronske kisline, pri čemer gostiteljska celica Bacillus vsebuje konstrukt nukleinske kisline, ki obsega kodirno sekvenco hialuronan sintaze, ki je operativno povezana s promotorsko sekvenco, ki je tuja kodirni sekvenci hialuronan sintaze; in ekstrakcijo hialuronske kisline iz gojišča.

6. Nanos hialuronske kisline

Hialuronska kislina je snov z ogromnim spektrom delovanja in resnično neverjetnimi lastnostmi. Nekaj let po odkritju hialuronske kisline se je začel razvoj zdravil na osnovi glukoznega aminolikana za zunanjo uporabo kot sredstvo za povečanje regenerativne in barierne funkcije kože. Vendar, kot je znano, snov, izdelana iz živalskih surovin, zahteva skrbno čiščenje nečistoč, kar nalaga dodatne proizvodne stroške in se odraža v ceni končnega izdelka. Dejansko so visoki stroški hialuronske kisline dolgo časa preprečevali razširitev obsega uporabe biopolimera, vendar pa je postopno večanje znanja o lastnostih polimera in uvedba biotehnoloških metod, ki temeljijo na mikrobni sintezi, omogočilo mogoče znatno znižati stroške snovi, kar spodbuja razvoj različnih aplikacij, v katerih se hialuronska kislina uporablja na področjih medicine, živilske, farmacevtske in kozmetične industrije. V teku so raziskave za ustvarjanje zdravil in prehranskih dopolnil na osnovi hialuronata s protivnetnimi, imunomodulatornimi in podaljševalnimi učinki, ki bi jih morda v prihodnosti lahko uporabili kot osnovo za zdravljenje bolezni v onkologiji, otorinolaringologiji, kirurgiji, endokrinologiji in mnogih drugih. druga področja človekove dejavnosti.

6.1. Hialuronska kislina v medicini

Hialuronska kislina ima protimikrobne in regenerativne učinke, zato so na njeni osnovi razvili zdravila za učinkovito zdravljenje kožnih lezij. Prvotno ustvarjena kot zdravila proti opeklinam, se ta skupina aktivno uporablja pri zdravljenju trofičnih motenj kožnega epitelija posttrombotičnega izvora. Dokazano je, da hialuronska kislina z nizko molekulsko maso (manj kot 10 kDa) deluje angiogeno, s čimer zmanjša nastanek adhezij in proliferacijo vezivnega tkiva, izboljša mikrocirkulacijo in zmanjša posledice vnetja.

Hialuronat ima lastnosti povečanja aktivnosti interferona, s čimer kaže izrazit protivirusni učinek. Dokazana je visoka aktivnost pripravkov na osnovi hialuronske kisline proti virusu herpesa in nekaterim drugim. Po nekaterih virih naj bi visokomolekularna hialuronska kislina podaljšala delovanje drugih biološko aktivnih snovi, ki so v njej raztopljene, zdravilne učinkovine pa se zaradi visoke viskoznosti hialuronata dolgo časa sproščajo v tkivo. Ustvari se tako imenovani depo, iz katerega BAS postopoma difundira v okolje telesa. To vam omogoča, da povečate terapevtsko širino, okrepite farmakološki učinek v nekaterih primerih, zmanjšate stranske učinke in razširite možnosti uporabe drugih zdravil (steroidov, antibiotikov, peptidov, nesteroidnih protivnetnih zdravil itd.) V kombinaciji s hialuronsko kislino. Široko uporabljen hialuronat v kirurgiji:

1. Oftalmološka kirurgija - natrijev hialuronat se uporablja kot reparativno sredstvo za kirurške posege na endotelnem sloju roženice (odstranitev katarakte).

2. Kirurška travmatologija - pri kirurških posegih z velikim prerezom hrustančnega tkiva in zapletenim artritisom se uporablja kot regenerativno, mazalno, protivnetno in analgetično sredstvo.

6.2. Hialuronska kislina v kozmetologiji

Uporaba hialuronata in njegovih soli v kozmetologiji temelji na sposobnosti pripravkov, ki vsebujejo hialuronat, da imajo lokalne protivnetne, celjenje ran in imunomodulatorne učinke. Sposobnost zadrževanja vode v medceličnem prostoru je osnova mehanizma za korekcijo starostnih deformacij kože. Trenutno so v kozmetološki praksi zelo priljubljene injekcije 1-3% vodne raztopine hialuronske kisline za intra- ali subkutano dajanje. Vnos hialuronske kisline v epitelij v obliki vodnega gela poveča elastičnost in čvrstost tkiv, s tem pa koži povrne nekdanje lastnosti in lepoto. Hialuronat z visoko molekulsko maso pa se pogosto uporablja pri izdelavi različnih kombiniranih krem in gelov za zunanjo uporabo. Ta vrsta izdelkov ima enak poudarek kot injekcije - obnoviti reološke lastnosti kože in s tem preprečiti nastanek gub, aken itd. .

Hialuronska kislina ima lastnosti, zaradi katerih je zelo primerna za uporabo kot dermalno polnilo: sposobna je vezati velike količine vode, je naravno prisotna v koži in ne povzroča neželenih reakcij. Polnila (Fill - iz angleščine - zapolniti) so injekcijska dermalna polnila, ki se uporabljajo v kozmetologiji za zmanjšanje globine gub, nazolabialnih gub in gub v ustnih kotih. Polnila se uporabljajo tudi za dodajanje dodatnega volumna obrazu v predelu ličnic, lic in ustnic.Trenutno je v široki uporabi skupina HA polnil družine Surgiderm in Juvederm Ultra A. Surgiderm in Juvederm Ultra sta homogeni monofazni geli hialuronske kisline neživalskega izvora. So eden najbolj fleksibilnih materialov za injekcijsko konturiranje, od česar ni odvisna le enostavnost njihovega vstavljanja, temveč tudi enakomerna porazdelitev v tkivih, kar omogoča popolno odpravo konturiranja materiala.

Sodobna serija preparatov na osnovi hialuronske kisline PRINCESS®. PRINCESS® Filler je sterilen, biorazgradljiv, viskoelastičen, prozoren, brezbarven, izotonični in homogeniziran gelni vsadek za intradermalno injiciranje. Premreženo hialuronsko kislino, ki jo vsebuje PRINCESS® Filler, proizvajajo bakterije Streptococcus equi in je v obliki raztopine s koncentracijo 23 mg/ml v fiziološkem pufru.

Zaključek

Hialuronska kislina je izdelek živalskega izvora, ki ima resnično neverjetne lastnosti in najvišji obseg uporabe tako zdaj kot v prihodnosti za svojo prihodnjo uporabo. Zato sploh ne preseneča, da njegove lastnosti preučujejo po vsem svetu.

Trenutno se preučujejo procesi in mehanizmi delovanja hialuronske kisline na telesno tkivo. Postavljene so hipoteze o vlogi hialuronata in sorodnih glikozaminoglikanov v procesih proliferacije, diferenciacije, migracije živalskih celic v procesih imunskega odziva in embriogeneze ter se poskuša ugotoviti povezava med molekulsko maso, stopnjo očiščenosti in in učinkovitosti zdravil.

Fizikalno-kemijska metoda se zaradi svoje ekonomske nedonosnosti postopoma umika biotehnološki metodi sinteze biopolimerov. Iskali so proizvajalce, ki so ustrezali vsem parametrom, ter različne vrste testov za preučevanje metabolizma hialuronskih kislin. Rezultat študije je bila identifikacija neposredne povezave med sposobnostjo sinteze hialuronske kisline in prisotnostjo specifičnih encimov hialuronat sintetaze.

V zadnjih 20 letih je bil operon, ki kodira sintezo hialuronskih sintetaz, izoliran v svoji čisti obliki in večkrat izražen v različnih vrstah mikroorganizmov, da bi dobili gensko spremenjene seve, ki proizvajajo hialuronske kisline. Vendar pa rezultata ni bilo mogoče doseči zelo dolgo. Gensko spremenjeni sevi so proizvajali neaktivno obliko encima, zato niso imeli sposobnosti proizvajanja hialuronske kisline. Toda nedavne študije o ustvarjanju gensko spremenjenega seva na osnovi bakterije Bacillus sibtilis so pokazale dobre rezultate. Bakterijski sevi so aktivno sintetizirali hialuronat z visoko molekulsko maso, brez peptidnih vključkov in vezi s sorodnimi mukopolisaharidi.

Vendar iskanje sevov proizvajalcev trenutno poteka. Preizkušajo se možnosti sinteze hialuronata z bakterijami iz rodu Streptomyces in na njihovi osnovi se razvija biotehnologija; Poleg tega se preučujejo načini uporabe in uvajanja hialuronata v vse družbene sfere.

Bibliografska povezava

Savoskin O. V., Semenova E. F., Rashevskaya E. Yu., Polyakova A. A., Gribkova E. A., Agabalaeva K. O., Moiseeva I. Ya. ZNAČILNOSTI RAZLIČNIH METOD ZA PRIDOBITEV HIALURONSKE KISLINE // Znanstveni pregled. Biološke vede. – 2017. – št. 2. – Str. 125-135;
URL: https://science-biology.ru/ru/article/view?id=1060 (datum dostopa: 13.12.2019). Predstavljamo vam revije, ki jih je izdala založba "Akademija naravoslovnih znanosti"

Hialuronska kislina je bil odkrit leta 1934, prve podrobne študije so se začele izvajati v letih 1949 - 1950. To snov so izolirali iz različnih živalskih tkiv – sklepne tekočine, popkovine in tkiva petelinjega glavnika. Poleg tega so leta 1937 iz streptokoknih kapsul pridobili hialuronsko kislino. Prve študije fizikalnih in kemijskih lastnosti hialuronske kisline so bile izvedene z rentgensko kristalografijo.

Težave s pridobivanjem HA

Glavna težava, s katero so se soočili znanstveniki pri proučevanju hialuronske kisline, je bila težava izolacije le-te v čisti obliki, očiščene iz beljakovin in drugih sestavin. Težava je nastala, ker je med čiščenjem vedno obstajala nevarnost uničenja polimerne strukture hialuronske kisline. Istočasno so znanstveniki preizkusili različne metode fizikalnega, kemičnega in encimskega čiščenja.

Malo kasneje so se začele raziskave o možnosti biosinteze hialuronske kisline. Leta 1955 je bila ta metoda prvič ugotovljena. Skupina znanstvenikov je izolirala molekule hialuronske kisline iz ekstrakta streptokokov. Zahvaljujoč temu odkritju je postalo mogoče sintetizirati hialuronsko kislino - z uporabo encimske frakcije, vzete iz streptokokov.

Hialuronska kislina - uporaba

Glavni preboj v uporabi hialuronske kisline se je zgodil v 50. letih. Zahvaljujoč odkritju te snovi za uporabo v medicini se je začela njena industrijska proizvodnja in popularizacija kot zdravilo.

Leta 1970 je bila hialuronska kislina odobrena kot dokazano zdravilo za artritis po pozitivnih rezultatih testiranja na živalih. Kot rezultat poskusa je bil opažen izrazit klinični učinek z zmanjšanjem simptomov.

Nekaj let kasneje so hialuronsko kislino začeli uporabljati v implantabilnih intraokularnih lečah, kar je hitro postalo ena najpogosteje uporabljenih komponent v kirurški oftalmologiji. Od tega trenutka so se začele predlagati in testirati različne metode in aplikacije hialuronske kisline.

GC za danes

V 90. letih hialuronska kislina je našel široko uporabo v estetski medicini in kozmetologiji, zahvaljujoč edinstvenim lastnostim zadrževanja vlage ter antiseptičnih in antioksidativnih lastnosti. Še danes se uporablja v različne kozmetične namene, raziskave njegovih lastnosti in možnih področij uporabe pa se nadaljujejo.

Živeti srečno do konca svojih dni, ne da bi se postaral ali umrl, so sanje vsakega človeka. Svet ne miruje in človeštvo je že na robu odkritja. Vse to bo postalo mogoče zaradi hialuronske kisline in njene uporabe v medicini in kozmetologiji.

Vsaka ženska se je vsaj enkrat v življenju srečala z izrazom hialuronska kislina. Vendar pa vsi ne razumejo, zakaj je hialuronska kislina tako cenjena v svetu kozmetologije. Zakaj ga priznavajo vsi kozmetologi in zdravniki?

Kaj je hialuronska kislina?

Hialuronska kislina je polisaharid iz družine glikozaminoglikanov, ki je ena izmed sestavin človeških tkiv in tekočin. To kislino najdemo tako v človeških celicah kot v živalskih celicah in celo bakterijah. Že od pouka biologije v šoli vemo, da je človeško telo sestavljeno iz celic, te pa tvorijo organe, prazen prostor med organi in celicami pa je zapolnjen z vezivnim tkivom.

Hialuronska kislina je del vezivnega tkiva in je glavni element medceličnega matriksa. Vezivno tkivo je lahko v tekočem ali trdnem stanju, pa tudi v obliki gela. V tekočem stanju je hialuronska kislina prisotna v slini, cerebrospinalni tekočini in tudi v sinovialni tekočini (tekočina, ki zapolnjuje sklepno votlino).

V trdnem stanju je hialuronat del kosti, v obliki gela pa je prisoten v steklovini, hrustancu in medcelični tekočini. Hialuronsko kislino v velikih količinah sintetizirajo v koži specifične celice – fibroblasti. Fibroblasti so celice vezivnega tkiva, katerih glavna naloga je, da poleg hialuronske kisline sintetizirajo kolagen in elastin.

Glavna količina vse hialuronske kisline je koncentrirana v koži, nahaja se v vezivnem tkivu dermisa med kolagenskimi in elastinskimi vlakni, pa tudi v celicah stratum corneuma (korneociti). Če potegnemo analogijo in si našo kožo predstavljamo kot vzmetnico, lahko rečemo, da sta kolagen in elastin vzmeti, hialuronska kislina pa penasta guma, ki zapolnjuje prostor med njima.

Kot smo ugotovili iz zgoraj navedenega, je hialuronska kislina naravna sestavina našega telesa. V njem se sintetizira in sodeluje v številnih bioloških procesih. Njegova vloga v telesu je res neprecenljiva.

Vloga hialuronske kisline v telesu

Hialuronska kislina ima izjemne lastnosti. Najpomembnejša in dragocena lastnost je sposobnost vezave in zadrževanja vode. Znano je, da ena molekula hialuronske kisline veže 500 molekul vode. Ima tudi tako imenovani "učinek plenice" - sposobnost, da ne sprošča vlage iz kože.

Kot pomembna sestavina zunajceličnega matriksa hialuronat zagotavlja vitalno aktivnost celic in zapolnjuje prostor med njimi. Hialuronska kislina sodeluje pri procesu proliferacije (rast tkiva z delitvijo celic), zagotavlja transport kisika, limfocitov in drugih krvnih molekul ter hranilnih snovi do mesta poškodbe tkiva in vnetja.

Toda malo ljudi ve, da ima hialuronat poleg svojih čudežnih lastnosti pomembno vlogo pri procesu migracije malignih tumorjev in širjenju streptokoknih okužb. Zato je presežek hialuronske kisline enako nevaren kot pomanjkanje: vse je odvisno od procesov, ki se dogajajo v telesu.

Nastajanje hialuronske kisline v telesu se lahko pospeši ali upočasni, njena količina se lahko poveča ali zmanjša, kar pa sploh ni povezano s starostjo. Kozmetologi so navajeni verjeti, da pomanjkanje hialuronske kisline v telesu služi kot določen pokazatelj staranja kože, zaradi česar je mogoče predpisati zdravila na njeni osnovi kot zdravljenje in preprečevanje starostnih sprememb kože. Ampak to ni res.

Najpomembnejši vzroki, ki spodbujajo sintezo hialuronata, so vnetje, poškodba tkiva ali poškodba. Na mestih poškodbe tkiva, vnetja ali poškodbe se količina hialuronske kisline znatno poveča.

Vrste hialuronske kisline

Glede na število fragmentov, ki sestavljajo molekulo hialuronske kisline, ima lahko različno težo in dolžino.

Nizkomolekularna hialuronska kislina ima izrazit protivnetni učinek. Uporablja se pri zdravljenju trofičnih ulkusov, opeklin, psoriaze in drugih kožnih bolezni. Ta vrsta hialuronata je vključena v izdelke za zunanjo uporabo: kreme, tonike, emulzije in serume. Sposobni so prodreti globoko v kožo, ne da bi pri tem izgubili svoje lastnosti.

Pomembna točka, ki jo morate upoštevati pri uporabi izdelkov na osnovi hialuronske kisline, je vlažnost zraka.

Pri nizki zračni vlagi ima hialuronska kislina nasprotni učinek od vlaženja. Zgornje plasti kože se napnejo, postanejo suhe, kar ustvarja učinek raztegnjene maske na obrazu. Da bi odpravili te neprijetne občutke, morate takoj po hialuronski kislini na obraz nanesti vlažilni serum ali negovalno kremo. Hranilna in vlažilna krema bo ustvarila občutek ugodja in lajšala neprijetne simptome. Nizkomolekularne oblike hialuronske kisline lahko povečajo elastičnost kože in delno zapolnijo že nastale gube.

Vbrizgana srednjemolekularna hialuronska kislina z maso od 100 do 500 kDa zaradi stimulacije fibroblastov sproži sintezo endogene (lastne) hialuronske kisline in proces neokolagenogeneze. Aktivno se uporablja tudi v medicinske namene, zlasti za zdravljenje nekaterih oblik artritisa in v oftalmologiji za zdravljenje oči.

Visokomolekularna oblika hialuronata se uspešno uporablja v kozmetologiji za izboljšanje navlaženosti kože in obnavljanje izgubljenih volumnov. Zaradi svojih lastnosti lahko zadrži veliko število molekul vode. Visokomolekularna hialuronska kislina od 900 kDa in več ima odlične restrukturirne in antioksidativne sposobnosti. Poleg tega je njeno odlaganje v tkivih dva tedna v primerjavi z nizkomolekularno hialuronsko kislino, ki ostane v tkivih en teden. Večja kot je molekulska masa hialuronata, boljša je morfogeneza polimerne mreže, bolj viskozna postane raztopina pri nizkih koncentracijah. To vam omogoča, da pokrijete veliko površino kože z neprekinjenim vlažilnim filmom.

Izgubljamo jo. Vzroki?

Sčasoma proces razgradnje hialuronske kisline v telesu prevlada nad njeno sintezo. Zakaj se to zgodi? Nenavadno, vendar v nasprotju s prevladujočim prepričanjem starost v tem procesu ne igra prevladujoče vloge. Glavni razlog je poškodba kože z ultravijoličnim sevanjem tipa A in B. Pod škodljivimi učinki UV sevanja pride do poškodb kožnih celic in zmanjšane sinteze hialuronske kisline.

Hkrati z zmanjševanjem hialuronske kisline v telesu se intenzivirajo procesi njene razgradnje, produkti razgradnje pa se kopičijo in zelo počasi odstranjujejo iz kože. Pravzaprav je ta proces zaščitna reakcija telesa, saj je UV sevanje glavni povzročitelj kancerogeneze, hialuronat pa sodeluje pri migraciji in presejanju tumorskih celic.

Drugi pomemben dejavnik, ki prispeva k razgradnji hialuronske kisline, je encim hialuronidaza. Hialuronidaza razgrajuje hialuronsko kislino in ta proces poteka neprekinjeno. Glavnina hialuronata se razgradi in ponovno obnovi v 24 urah. Popolna obnova celotne količine hialuronske kisline se pojavi v 3-4 dneh. In to vključuje razgradnjo in novo sintezo hialuronata v vseh tkivih telesa. Razlog za propad je lahko:

starost;
ultravijolično sevanje;
neuravnotežena prehrana;
slabe navade (nikotin, alkohol);
psiho-čustveno stanje;
jemanje določenih zdravil.

Ti razlogi ne vplivajo le na količino sintetizirane hialuronske kisline, temveč tudi na njeno strukturo. Zmanjšanje količine hialuronske kisline prispeva k zmanjšanju vode v sestavi nekaterih celičnih struktur in pojavu prvih znakov staranja.

Poleg tega lahko naravni procesi, povezani s staranjem, povzročijo povečanje volumna hialuronske kisline v dermisu, kar lahko povzroči medcelični edem na eni strani in dehidracijo površinskih plasti kože na drugi strani.

Vsi ti procesi negativno vplivajo na stanje kože. Postane suha, mlahava, izgublja prožnost in čvrstost, na njej se oblikujejo številne gube. In kot rezultat: odsev v ogledalu ni prav nič prijeten in postane vir žalosti.

Hialuronska kislina v kozmetologiji

V kozmetologiji se uporabljata dve industrijski vrsti hialuronske kisline:

živalskega izvora;
temelji na biotehnološki sintezi.

V kozmetologiji se že dolgo uporablja hialuronska kislina živalskega izvora. Pridobili so ga z drobljenjem živalskih organov (glavniki zrelih petelinov, popkovine) kot rezultat dvofaznega čiščenja. Ta pripravek je ohranil živalske beljakovine in peptide, kar je prispevalo k razvoju alergijskih reakcij in zavrnitve zdravila.

Telo je to obliko hialuronata pozicioniralo kot tujek in sprožilo reakcijo, da bi tujek odstranilo. Vse to je seveda vplivalo na estetski rezultat posega. In namesto dolgo pričakovanega pomlajevanja so bili dodani nepotrebni napori za odpravo nastalih zapletov. Dandanes se hialuronska kislina živalskega izvora skoraj ne uporablja.

Toda znanost ne miruje. Ustvarjajo se nove tehnologije in zdravila, ki lahko popolnoma zmanjšajo stranske učinke, zaplete in tveganja. Zato se hialuronska kislina, pridobljena z biokemijsko sintezo, zdaj uporablja v kozmetologiji.

Za te namene se uporabljajo bakterijske kulture, zlasti streptokoki, gojeni na rastlinski osnovi (pšenična juha). Ta metoda temelji na sposobnosti nekaterih mikroorganizmov, da sintetizirajo hialuronsko kislino. Biokemijska metoda vam omogoča, da dosežete veliko količino snovi z želeno molekulsko maso in sprejemljivo strukturo.

Neposredno uporabljen v polnilih:

stabilizirano (domače, naravno);
nestabiliziran (kemično modificiran).

Učinek hialuronske kisline je neposredno odvisen od njene vrste. Vsaka vrsta ima svoje prednosti in učinke. Zelo pomembna je stopnja čiščenja zdravila. Nekateri pripravki na osnovi hialuronata vsebujejo dodatne snovi v obliki vitaminov, aminokislin in biološko aktivnih snovi. Druge so »čiste«, vsebujejo samo hialuronsko kislino, ki deluje kot samostojna komponenta. Stabilizirana hialuronska kislina velja za najučinkovitejšo.

Pripravki na osnovi stabilizirane hialuronske kisline se v koži dolgotrajno hranijo, tvorijo osnovo hidrorezervnih pripravkov in sprožijo regenerativne procese v dermisu.

Molekula hialuronske kisline je zelo občutljiva. Ostro reagira na kemične spremembe: toplotne ali mehanske. Zaradi tega ga je treba med kemičnimi reakcijami ustrezno ohraniti. Stabilizirano hialuronsko kislino pridobimo z biokemično sintezo, ki ji sledi proces navzkrižnega povezovanja, imenovan stabilizacija (tvorba prepletajočih se navzkrižnih povezav med molekulami hialuronske kisline).

Molekule hialuronske kisline so zamrežene, da se prepreči njihova hitra razgradnja. Ta hialuronska kislina ima ob vnosu v kožo dolgotrajne klinične učinke. Nastali geli se po zamreženju podvržejo čiščenju, kar je zelo mukotrpen proces in je odločilen dejavnik pri oblikovanju cene stabilizacijskih pripravkov hialuronske kisline.

Glede na stopnjo stabilizacije se proizvajajo geli različnih viskoznosti za odpravljanje različnih estetskih težav: manj stabilizirani - za odpravo drobnih gub, bolj stabilizirani in bolj viskozni - za korekcijo nazolabialnih gub in povrnitev izgubljenega volumna.

Stabilizirana hialuronska kislina se uporablja v praksi oblikovanja kontur in za krepitev obraza, saj ta vrsta hialuronata dobro drži volumen. To pomeni, da je treba napolniti izgubljene količine, na primer ličnice, potisniti nazolabialne gube od zunaj, oblikovati konturo obraza in zapolniti vrzeli na obrazu, se uporablja stabilizirana hialuronska kislina.

Nestabilizirana hialuronska kislina se uporablja v mezoterapiji in biorevitalizaciji za hidracijo tkiv in izboljšanje elastičnosti kože.

Injekcijske metode na osnovi hialuronske kisline

Injekcijske metode in tehnike na osnovi pripravkov hialuronske kisline dajejo fantastične rezultate. Vendar pa vsa hialuronska kislina ne izboljša lastnosti kože. Da se v dermisu sprožijo regeneracijski mehanizmi, mora biti izpolnjenih več pogojev:

Hialuronat mora biti stabiliziran (naravni, nativni).
Molekulska masa hialuronata mora presegati 1 milijon Daltonov.
Koncentracija hialuronske kisline v pripravku mora presegati 15 mg na mililiter.
Hialuronska kislina mora imeti viskozno konsistenco.

Če ti pogoji niso izpolnjeni, se fibroblasti ne aktivirajo in proces pomlajevanja ne steče.

Pripravki na osnovi hialuronske kisline se uporabljajo v naslednjih tehnikah injiciranja:

biorevitalizacija;
mezoterapija;
bioreparacija;
redermalizacija;
konturna plastika;
bioojačitev.

Biorevitalizacija– najbolj priljubljen in učinkovit postopek v kozmetologiji. Temelji na vnosu hialuronske kisline v srednje plasti kože. Uporablja se pri vseh primerih starostnega staranja kože, pri zdravljenju aken in poporodnih strij.

Mezoterapija– uvedba hialuronske kisline in koktajlov na njeni osnovi z večkratnimi injekcijami.

Bioreparacija– vnos hialuronske kisline z vitamini, aminokislinami in peptidi.

Redermalizacija– dajanje injekcij hialuronske kisline in natrijevega sukcinata (derivat jantarne kisline).

Konturna plastika– dopolnitev izgubljenih volumnov s hialuronskim gelom.

Bioojačitev obraza– obnovitev obrisa ovala obraza s hialuronskim biogelom.

Kontraindikacije za uporabo hialuronske kisline

Kljub dejstvu, da hialuronsko kislino sintetizira naše telo in imajo modificirani pripravki na njeni osnovi visoko stopnjo čiščenja, še vedno obstajajo primeri zavrnitve zdravila in alergijskih reakcij. To je posledica dejstva, da je nemogoče popolnoma očistiti nastali pripravek iz vsebnosti tujih beljakovinskih nečistoč. Prav te nečistoče povzročajo neželene stranske učinke in zaplete. Tudi dodatno vnašanje hialuronske kisline v telo lahko povzroči nepredvidene posledice, saj ima veliko vlogo pri migraciji malignih tumorjev in širjenju različnih okužb.Obstajajo številne resne kontraindikacije, ki jih je treba upoštevati.

Pripravkov na osnovi hialuronske kisline ne smete uporabljati v naslednjih primerih:

avtoimunske in onkološke bolezni;
nalezljive in kronične bolezni v akutni fazi;
nosečnost in dojenje;
vnetje kože na obrazu;
individualna nestrpnost do zdravila.

Neupoštevanje teh opozoril lahko povzroči resne posledice.

Hialuronska kislina – dejstva in fikcija

Vsaka čudežna snov povzroča veliko polemik in špekulacij, v katerih je zelo malo resnice, a veliko fikcije. Preveč vtisljivi ljudje hialuronski kislini pripisujejo čarobne in magične lastnosti, nato pa povsod iščejo trike in skrite zarote. Poglejmo nekaj uveljavljenih mitov.

Prvi mit: injekcije hialuronske kisline povzročajo odvisnost.

To ni res. "Useti se na iglo" je možno le s psihološkega vidika. Ko pacient uporablja učinkovite kozmetične izdelke, opazi, kako se njegov videz izboljšuje. To stanje mu je všeč, njegova samozavest se dvigne, začne se navaditi nanj. Želja po lepšem videzu se povečuje. Ampak to nima nobene zveze s hialuronsko kislino. Hialuronska kislina v kremah deluje samo na površinsko plast povrhnjice. V injekcijah hialuronska kislina stimulira lastne celice in jih vrne v naravne procese, na katere so z dozorevanjem kože pozabile. In po preteku roka uporabnosti se hialuronska kislina v telesu razgradi in popolnoma izgine. Nikakor ne more povzročiti odvisnosti.

Drugi mit: velika molekulska teža hialuronske kisline ne dovoljuje, da prodre v kožo.

Delno drži. Če govorimo o kozmetičnih pripravkih v obliki krem, emulzij, serumov, potem je tako. Ta zdravila so zasnovana za "delovanje" v zgornjih plasteh povrhnjice. Niso zdravilo in ne smejo prodreti skozi kožno pregrado. Toda dejstvo je, da so se znanstveniki že dolgo naučili zdrobiti molekulo hialuronske kisline in ustvariti njene nizkomolekularne oblike. Hialuronska kislina z nizko molekulsko maso, ki jo vsebuje krema, je zelo sposobna prodreti v kožo.

Tretji mit: hialuronska kislina v injekcijah poveča očesni tlak.

Hialuronska kislina je del številnih bioloških tekočin, je sestavni del našega telesa, prisotna je v številnih organih, zlasti je del steklastega telesa. Prvič v zgodovini so hialuronsko kislino začeli uporabljati v oftalmologiji. Zaradi tega nikakor ne more povečati očesnega tlaka.

Četrti mit: lepotne injekcije botulina in hialuronske kisline so enake.

Zelo ignorantska izjava. Botulin je nevrotoksin, odpadni produkt bakterije Clostridium botulinum. Zdravila na osnovi botulina paralizirajo mišico in preprečujejo njeno krčenje. Ne vpliva na kožne mehanizme, ne sproži procesa regeneracije celic, ampak le začasno sprosti mišico in s tem pomaga pri odpravljanju gub. Hialuronska kislina je del našega telesa, sproži procese regeneracije in aktivacije dermalnih celic, kožo vlaži in ji povrne izgubljene količine. To sta dve popolnoma različni snovi, imata različni funkciji in vlogi.

Zelo pogosta napačna predstava. Kožo je treba zaščititi v vsakem letnem času, še posebej pozimi, ko suh klimatiziran zrak in vroč zrak iz notranjih radiatorjev prispevata k izsušitvi in dehidraciji kože. Vedeti morate le, da vlažilno kremo nanesete pol ure preden greste na mraz. V tem obdobju leta morate kožo intenzivno hraniti in vlažiti.

Šesti mit: injekcije hialuronske kisline črpajo vlago iz globokih plasti kože.

Seveda to ne drži. Vse se zgodi ravno obratno. Hialuronska kislina kožo navlaži in nasiči z vlago. V našem telesu se vsak dan dogaja razgradnja in sinteza hialuronske kisline. In vsake tri do štiri dni se količina hialuronske kisline v vseh sistemih in organih popolnoma obnovi. Injekcije ali kreme ne morejo "povleči" vode iz globokih plasti kože tudi zato, ker ima hialuronska kislina "plenični učinek" in ne odvaja vlage iz kože.

V sodobni kozmetologiji se je pojavilo močno orodje - hialuronska kislina. Postala je predmet resnih znanstvenih raziskav in se začela aktivno uporabljati v estetski medicini. V zadnjih nekaj letih je hialuronska kislina dokazala svojo učinkovitost, priznano po vsem svetu. Na njegovi osnovi je bila zgrajena celotna industrija tehnologij in zdravil proti staranju. A da se ne ujamete v past lastnih odvisnosti, se morate seznaniti z njegovimi zdravilnimi učinki, načini pridelave in vrstami. Navsezadnje lahko tudi najbolj čudežno zdravilo prinese tako korist kot škodo.

Bodite zanimivi z!

V tem zgodovinskem pregledu, posvečenem hialuronska kislina, smo skušali obiskovalca spletne strani opozoriti na najpomembnejša odkritja in raziskave, na katerih je bilo zgrajeno vse nadaljnje delo na področju preučevanja tega edinstvenega polisaharida. Izbor podatkov in virov za pregled je povsem subjektiven.

UVOD

Trenutno ni bistveno novih podatkov o hialuronski kislini, zato smo se odločili, da temo tega kratkega članka naredimo "Hialuronska kislina - zgodovina". S trenutnim tempom znanstvene misli nimajo vsi dovolj časa, da bi se ozrli nazaj in pregledali literaturo, ki opisuje ključna odkritja na tem področju. hialuronska kislina Zato smo poskušali na kratko povzeti obstoječe rezultate. Izbor virov in podatkov temelji le na našem znanju in mnenju in se lahko razlikuje od pogledov drugih.

KAKO SE JE VSE ZAČELO

Madžarski znanstvenik Bandi Balazs je leta 1947 emigriral z Madžarske. Ob prihodu na Švedsko se je v Stockholmu začel ukvarjati s problemom biološke vloge zunajceličnih polisaharidov, pri čemer je posebno veliko pozornosti namenil hialuronat.

V tistih letih je delo na celičnih kulturah izgledalo popolnoma drugače. Pred pojavom antibiotikov so vse manipulacije izvajali v strogo sterilnih pogojih, podobnih pogojem v operacijski sobi. Celice smo gojili na suspendiranih fibrinskih strdkih. Fibroblaste smo izolirali iz zdrobljenih piščančjih src, katerih koščke smo položili na fibrinske strdke, hitrost rasti kulture pa določili s spremembo površine kolonije, ki je kazala na hitrost in razdaljo celične migracije.

Eno prvih odkritij je bila izolacija iz tkiva popkovine hialuronat da bi ga nato vnesli v kulturo fibroblastov.

Hialuronat izoliran iz popkovnične krvi in oborjen v alkohol. Nato smo ga očistili iz beljakovin s stresanjem ekstrakta v mešanici kloroforma in izoamilnega alkohola (po metodi Sewag). Poskušali smo razviti metodo za sterilizacijo viskozne raztopine hialuronata. Ni ga bilo mogoče filtrirati, zato so se znanstveniki sčasoma zatekli k avtoklavu.

Na samem začetku dela so bile podane tri zelo pomembne ugotovitve, ki so postavile temelje za nadaljnje raziskave.

Najprej je bilo mogoče izolirati hialuronat iz tkiva popkovine in pod različnimi ionskimi pogoji je bil pridobljen material z različnimi stopnjami viskoznosti. Največjo viskoznost je imela raztopina, pripravljena z destilirano vodo. Znanstveniki so domnevali, da lahko viskoznost raztopine hialuronata niha glede na pH vrednost in ionsko moč topila. Zdaj to že vsi vedo, vendar je takrat ta pojav opisal Raymond Fuoss le za raztopine sintetičnih polielektrolitov. Journal of Polymer Chemistry je objavil članek "Viskoznostna funkcija hialuronske kisline kot polielektrolita." Od tega trenutka so znanstveniki začeli natančno preučevati fizikalne in kemijske lastnosti hialuronata.

Drugič, pri poskusu sterilizacije hialuronata z UV-sevanjem je popolnoma izgubil viskoznost v raztopini. Kasneje se je izkazalo, da se hialuronat ob izpostavitvi pretoku elektronov popolnoma razgradi. Zdaj lahko rečemo, da je bila ta ugotovitev eden prvih opisov cepitve hialuronata s prostimi radikali.

Tretjič, proučevali so tudi biološke učinke hialuronat in številni sulfatirani polisaharidi - heparin, heparan sulfat (ki se je v tistih letih imenoval "heparin-monosulfurna kislina") in sintetično sulfatiran hialuronat. Znanstveniki so primerjali njihove učinke na rast celične kulture, antikoagulantno aktivnost in antihialuronidazno aktivnost. Glavni cilj je bil ugotoviti, ali je heparin res sulfatiran hialuronat, kot je navedeno v delih Asboe-Hansena, vendar je bilo ugotovljeno, da je ta izjava napačna.

Hialuronat je za razliko od sulfatiranih polisaharidov pospešil rast celic in to je bil morda eden prvih opisov interakcije hialuronata z živimi celicami – danes vemo, da to interakcijo posreduje celični receptor. Zanimivo je, da je bila to tudi ena prvih študij, ki je preučevala biološko aktivnost heparan sulfata.

Vse omenjene raziskave so bile izvedene v kratkem času, od septembra 1949 do decembra 1950, torej so trajale le nekaj več kot 1 leto.

ODKRITJE HIALURONATA IN HIALURONIDAZE

Karl Meyer je odprl hialuronat leta 1934 med delom na očesni kliniki na univerzi Columbia State. To spojino je izoliral iz steklastega telesa kravjega očesa v kislih pogojih in jo poimenoval hialuronska kislina iz grškega hyalos – steklovina in uronska kislina, ki je bila del tega polimera. Takoj je treba povedati, da so bili prej izolirani drugi polisaharidi (hondroitin sulfat in heparin). Še več, leta 1918 sta Levene in Lopez-Suarez izolirala polisaharid, sestavljen iz glukozamina, glukuronske kisline in majhne količine sulfatnih ionov iz steklastega telesa in popkovnične krvi. Potem so ga imenovali mukoitin-žveplova kislina, zdaj pa je bolj znan kot hialuronat, ki so ga pri svojem delu izolirali z majhno primesjo sulfata.

V naslednjih desetih letih so Karl Meyer in številni drugi avtorji izolirali hialuronat iz različnih tkiv. Našli so ga na primer v sklepni tekočini, popkovini in tkivu petelinjega glavnika. Najbolj zanimivo je bilo, da je leta 1937 Kendallu uspelo izolirati hialuronat iz streptokoknih kapsul. Pozneje je bil hialuronat izoliran iz skoraj vseh tkiv telesa vretenčarjev.

Še pred odkritjem hialuronata je Duran-Reynals odkril določen biološko aktiven faktor v modih. Kasneje so ga začeli imenovati "faktor širjenja". Podoben učinek sta imela čebelji strup in medicinske pijavke. Pri subkutanem dajanju v mešanici s črnilom so opazili zelo hitro širjenje črne barve. Ta dejavnik se je izkazal za encim, ki uničuje hialuronati, ki se je pozneje imenovala hialuronidaza. Tudi v krvi sesalcev je določena količina hialuronidaz, vendar se njihova aktivacija pojavi le pri kislih pH vrednostih.

SPROŠČANJE HIALURONATA

Prva metoda za izolacijo hialuronata je bil standardni protokol za izolacijo polisaharidov, to je z metodo Sewag ali z uporabo proteaz, da so iz ekstrakta odstranili vse beljakovine. Polimer smo nato oborili v frakcije z dodatkom etilnega alkohola.

Velik korak naprej je bilo ločevanje različno nabitih polisaharidov, ki ga je razvil John Scott med proučevanjem metod obarjanja s kationskim detergentom (CPC, cetilpiridinijev klorid), v katerem so spreminjali koncentracijo soli. Hialuronat je bil z visoko učinkovitostjo ločen od sulfatiranih polisaharidov. To metodo bi lahko uporabili tudi za frakcioniranje molekulske mase. V bistvu lahko podobne rezultate dobimo z uporabo metode ionske izmenjevalne kromatografije.

STRUKTURA IN KONFORMACIJA HIALURONATA

Kemično strukturo molekule polisaharida je dešifriral Karl Meyer in njegovi sodelavci v petdesetih letih prejšnjega stoletja. Zdaj vsi vedo, da je hialuronat dolga polimerna molekula, sestavljena iz disaharidnih enot, katerih sestavini sta N-acetil-D-glukozamin in D-glukuronska kislina, povezani z vezmi B1-4 in B1-3. Karl Meyer ni uporabil standardne metode za preučevanje strukture nedotaknjenega polisaharida. Namesto tega je porabil hialuronidaza cepitev polisaharida, pri čemer nastane mešanica disaharidov in oligosaharidov, ki jo je lahko v celoti okarakteriziral. Na podlagi pridobljenih rezultatov je sklepal o možni strukturi prvotne polimerne molekule.

Konformacijska analiza "vlaken", sestavljenih iz hialuronata, je bila najprej opravljena z uporabo rentgenske kistalografije. Na konferenci v Turkuju leta 1972 je med skupinami strokovnjakov potekala burna razprava o tem, ali ima hialuronat spiralno strukturo ali ne. Očitno je, da lahko hialuronat tvori vijačnice različnih struktur, odvisno od ionske sestave topila in deleža vode v njem. V 70. in 80. letih prejšnjega stoletja so se v literaturi pojavile različne različice strukture hialuronata.

Preboj na tem področju je bilo delo Johna Scotta. Na podlagi dejstva, da ima hialuronat med peroksidazno oksidacijo v vodni raztopini nizko reaktivnost, je sklepal, da v vodi prevzame konformacijo z znotrajverižnimi vodikovimi vezmi. Kasneje je bila njegova hipoteza potrjena z NMR analizo in leta 1927 je Atkins s sodelavci konformacijo označil kot dvojno spiralno.

FIZIKALNE IN KEMIJSKE LASTNOSTI

Pred petdesetimi leti kemijska struktura hialuronata in njegove makromolekularne lastnosti – masa, homogenost, oblika molekule, stopnja hidracije in interakcija z drugimi molekulami – niso bile poznane. V zadnjih 20 letih je to postalo predmet pozornosti A. G. Ogstona in njegovih kolegov v Oxfordu, dr. Balazsa in kolegov v Bostonu, Torvarda C Laurenta, ki dela v Stockholmu, in več drugih laboratorijev.

Glavna težava je bila izolacija hialuronata, očiščenega iz beljakovin in drugih komponent, ki jo je treba izvesti pred kakršnimi koli fizikalnimi raziskovalnimi metodami. Med postopkom čiščenja vedno obstaja nevarnost degradacije strukture polimera. Ogston je uporabil tehniko ultrafiltracije, ob predpostavki, da bodo prosti proteini premagali filter, vezani proteini pa hialuronat, bo filter zadržal. Predmet študije je bil kompleks z vsebnostjo beljakovin 30%. Drugi avtorji so poskušali uporabiti različne fizikalne, kemične in encimske metode čiščenja, ki so omogočile zmanjšanje vsebnosti beljakovin na nekaj odstotkov. Hkrati so rezultati fizikalno-kemijske analize omogočili popolnejši opis molekule hialuronat. Njegova molekulska masa je blizu nekaj milijonov, čeprav je bila razpršenost med vzorci precej velika. Sipanje svetlobe je pokazalo, da se molekula obnaša kot naključno zvita, dokaj gosto zapakirana veriga s polmerom upogiba približno 200 nm. Pakiranje in nizka mobilnost verige je povezana s prisotnostjo znotrajverižnih vodikovih vezi, ki so bile že omenjene zgoraj. Naključno zvita struktura popolnoma ustreza dobljenemu razmerju viskoznosti in molekulske mase snovi. Ogston in Stanier sta uporabila metode sedimentacije, difuzije, strižne hitrosti in gradienta viskoznosti ter metode dvolomnosti, da bi pokazala, da ima molekula hialuronata obliko visoko hidrirane krogle, kar je skladno z znanimi lastnostmi molekul z embalažo v obliki naključnega zvita vijačnica.

ANALITIČNE TEHNIKE

Edini možni način za kvantitativno študijo hialuronske kisline je bila izolacija polisaharida v njegovi čisti obliki in merjenje vsebnosti uronske kisline in/ali N-acetilglukozamina v njem. Metodi izbire v tem primeru sta bili karbazolna metoda po Discheju za ocenjevanje vsebnosti uronske kisline in Elson-Morganova reakcija za koncentracijo heksozamina.

V tem primeru je težko preceniti pomen uporabe metode karbazola. Pri analizi hialuronata je bilo včasih treba uporabiti miligrame snovi.

Naslednji korak je bilo odkritje specifičnih encimov. Glivična hialuronidaza Streptomyces deloval samo na hialuronat, v tem primeru so nastali nenasičeni heksa- in tetrasaharidi. Pri analizi vsebine hialuronat To lastnost gob bi lahko izkoristili, zlasti ob prisotnosti drugih polisaharidov in nečistoč v mediju, nenasičeno obliko hialuronske kisline pa bi lahko uporabili za zmanjšanje meje zaznavnosti izdelka. Encimska metoda je znatno povečala občutljivost detekcije hialuronata na mikrogramsko raven.

Zadnji korak je bila uporaba afinitetnih proteinov, ki se specifično vežejo na hialuronat. Tengblad je uporabil proteine, ki vežejo hialuronat iz hrustanca, Delpech pa je nadalje uporabil hialuronektin, izoliran iz možganov. Te proteine je mogoče uporabiti pri analizah, podobnih imunološkim metodam, po razvoju te metode pa je natančnost kvantifikacije hialuronat povečana na nanogramsko raven, kar je omogočilo določitev vsebnosti hialuronat v vzorcih tkiv in fizioloških tekočinah. Metoda Tengblad je postala osnova za večino uppsalskega kasnejšega dela.

VIZUALIZACIJA HIALURONATA

Zaznavanje hialuronata v tkivnih rezih je tesno povezano z analizo polimerov v tkivni tekočini. Od vsega začetka so bile uporabljene nespecifične metode barvanja s standardnimi barvili. John Scott je lahko povečal specifičnost z istim principom, ki je vodil njegov razvoj metode za frakcioniranje anionskih polisaharidov v detergentih. Barval jih je z alcian modrim barvilom v različnih ionskih koncentracijah in uspel doseči razločno obarvanost različnih polisaharidov. Kasneje je prešel na kupromeronsko modro.

Hkrati je mogoče hialuronat jasno zaznati na odsekih tkiva s pomočjo beljakovin, ki se specifično vežejo nanj. Prva poročila o tej metodi so bila objavljena leta 1985. Ta metoda je bila zelo uspešno uporabljena in zahvaljujoč njej so bili pridobljeni dragoceni podatki o porazdelitvi vsebnosti hialuronata v različnih organih in tkivih.

Hialuronat lahko odkrijemo tudi z elektronsko mikroskopijo. Na prvih slikah, ki jih je objavil Jerome Gross, na žalost ni bilo mogoče videti nobenih drobnih podrobnosti strukture. Prvo delo, ki je dobro pojasnilo rezultate, je bil članek Fesslerja in Fesslerja. Navaja, da ima hialuronat razširjeno enoverižno strukturo.

Robert Fraser je nato opisal še eno elegantno metodo za vizualizacijo pericelularnega hialuronat. V kulturo fibroblastov je dodal suspenzijo delcev hialuronata. V debelem sloju, ki obdaja kulturo fibroblastov, delcev niso zaznali. Tako je bilo dokazano, da je v pericelularnem prostoru hialuronat, ki je podvržen cepljenju pod delovanjem hialuronidaze.

ELASTIČNOST IN REOLOGIJA

Na podlagi velikosti ene največjih molekul hialuronat, je enostavno domnevati, da pri koncentraciji približno 1 g/l skoraj popolnoma nasičijo raztopino. Pri visokih koncentracijah se molekule zapletejo, raztopina pa je nekakšna mreža hialuronatnih verig. Točka polimerizacije se določi precej enostavno - to je trenutek nasičenja raztopine, po katerem se njena viskoznost močno poveča, ko se koncentracija poveča. Druga lastnost raztopine, ki je odvisna od njene koncentracije, je hitrost premika viskoznosti. Ta pojav sta opisala Ogston in Stanier. Elastične lastnosti raztopine se spreminjajo z večanjem koncentracije in molekulske mase polimerov. Fluidnost čistega hialuronat sta prva določila Jensen in Koefoed, podrobnejšo analizo viskoznosti in elastičnosti raztopine pa so izvedli Gibbs in sod.

Ali je to zanimivo obnašanje raztopine posledica čisto mehanskega prepletanja polimernih verig ali je povezano tudi z njihovo kemično interakcijo? Zgodnje delo, ki ga je objavil Ogston, je razpravljalo o možnih interakcijah, posredovanih z beljakovinami. Welsh in drugi so prejeli znake obstoja interakcij med verigami. To smo dosegli tako, da smo raztopini dodali kratke verige hialuronata (60 disaharidov), kar je povzročilo zmanjšanje njene elastičnosti in viskoznosti. Očitno je prišlo do tekmovalne interakcije med kratkimi in dolgimi verigami. Kasnejše delo Johna Scotta je pokazalo, da je bila konformacija hialuronata s hidrofobnimi vezmi med verigami dobro skladna s težnjo hialuronata, da tvori vijačnice z bližnjimi molekulami, ki so bile stabilizirane s hidrofobnimi vezmi. Tako je najverjetnejša medverižna interakcija, ki v veliki meri določa reološke lastnosti hialuronat.

FIZIOLOŠKA VLOGA HIALURONSKIH POLIMEROV

Odpiranje tkanih verig hialuronat naraščajoče koncentracije, ki se lahko pojavijo v tkivih, so vodile do domneve, da je lahko hialuronat vključen v številne fiziološke procese z ustvarjanjem velike tridimenzionalne mreže verig. Obravnavane so bile najrazličnejše lastnosti takih omrežij.

Viskoznost. Zelo visoko viskoznost koncentriranih raztopin hialuronata, kot tudi odvisnost striga od viskoznosti, lahko uporabimo za mazanje sklepov. Hialuronat je vedno prisoten v vseh prostorih, ki ločujejo gibljive elemente telesa – v sklepih in med mišicami.

Osmotski tlak. Osmotski tlak raztopin hialuronat v veliki meri odvisno od njihove koncentracije. Pri visokih koncentracijah je koloidno-osmotski tlak takšne raztopine višji kot pri raztopinah albumina. To lastnost lahko uporabimo v tkivih za vzdrževanje homeostaze.

Pretočni upor. Gosta mreža verig je dokaj dobra ovira za pretok tekočine. Hialuronat lahko dejansko povzroči ovire za pretok tekočine v tkivih, kar je prvi pokazal Day.

Izključen obseg. Tridimenzionalna mreža verig izpodriva vse druge makromolekule iz raztopine. Razpoložljivo prostornino je mogoče izmeriti z dializno izravnavo raztopine hialuronata in pufrske raztopine, pri čemer je bilo ugotovljeno, da dobljeni učinek sovpada z izračunanim iz teoretičnih študij, ki jih je izvedel Ogston. O učinku izključitve so razpravljali v zvezi z delitvijo beljakovin v žilni plasti in zunajceličnem prostoru, vendar so ga obravnavali tudi kot mehanizem za kopičenje fizioloških in patoloških molekul v vezivnem tkivu. Izključitev polimerov zmanjša topnost mnogih beljakovin.

Difuzijska pregrada. Gibanje makromolekul skozi raztopino hialuronat se lahko meri s sedimentacijsko in difuzijsko analizo. Večja kot je molekula, manjša je hitrost njenega gibanja. Ta učinek je bil povezan z nastankom difuzijskih pregrad v tkivih. Na primer, pericelularna plast hialuronata lahko zaščiti celice pred učinki makromolekul, ki jih sproščajo druge celice.

BELJAKOVINE, KI VEŽEJO HIALURON (HIALADHERINI)

Proteoglikani. Do leta 1972 je veljalo, da je hialuronat inertna spojina in ni v interakciji z drugimi makromolekulami. Leta 1972 sta Hardingham in Muir to pokazala hialuronat se lahko veže na proteoglikane hrustančnega tkiva. Študije Hascalla in Heinegarda so pokazale, da se lahko hialuronat specifično veže na N-terminalno domeno globularnega dela proteoglikanov in spojnih proteinov. Ta vez je precej močna in več proteoglikanov se lahko pritrdi na eno verigo hialuronata, kar povzroči nastanek velikih agregacije molekul v hrustancu in drugih tkivih.

Hialuronatni receptorji. Leta 1972 so Pessac in Defendi ter Wasteson et al pokazali, da se suspenzije nekaterih celic začnejo združevati, ko je dodan hialuronat. To je bilo prvo poročilo, ki kaže na specifično vezavo hialuronat s površino celic. Leta 1979 sta Underhill in Toole to pokazala hialuronat dejansko veže na celice in leta 1985 je bil izoliran receptor, ki je odgovoren za to interakcijo. Leta 1989 sta dve skupini avtorjev objavili članke, ki so pokazali, da ima limfocitni homing receptor CD44 sposobnost vezave na hialuronat v hrustančnem tkivu. Kmalu se je pokazalo, da je receptor, ki sta ga izolirala Underhill in Toole, popolnoma enak CD44. Še en hialuronat-vezni protein, ki so ga Turley et al. pozneje izolirali iz supernatanta celične kulture 3T3 leta 1982, se je izkazalo, da je GHRP (hialuronatni receptor gibljivosti). Po teh delih so odkrili celo vrsto hialadherinov.

VLOGA HIALURONATA V CELICI

Do odkritja hialaherinov je veljalo, da hialuronat deluje na celice le s fizičnimi interakcijami. Podatki, da lahko hialuronat igra vlogo v bioloških procesih, so bili sporadični in so večinoma temeljili na odsotnosti ali prisotnosti hialuronata v različnih bioloških procesih. Velik del špekulacij tistega časa je temeljil na nespecifičnih tehnikah histološkega barvanja.

Zelo zanimiva študija je bila narejena v Bostonu v zgodnjih sedemdesetih letih. Bryan Toole in Jerome Gross sta pokazala, da med regeneracijo okončin pri paglavcih hialuronat se sintetizira na samem začetku, nato pa se njegova količina pod delovanjem hialuronidaze zmanjša, hialuronat pa nadomesti hondroitin sulfat. Dogodki se razvijajo na enak način med nastankom roženice pri piščancu. Toole je poudaril, da kopičenje hialuronata sovpada z obdobji migracije celic v tkiva. Kot je navedeno zgoraj, je Toole izvedel tudi prve študije membransko vezanih hialaderinov in z odkritjem hialuronatnih receptorjev imamo več razlogov za domnevo, da hialuronat igra vlogo pri uravnavanju celične aktivnosti, na primer med gibanjem celic. V zadnjih 10 letih lahko opazimo porast števila publikacij, posvečenih vlogi hialuronata pri celični migraciji, mitozi, vnetju, rasti tumorja, angiogenezi, oploditvi itd.

BIOSINTEZA HIALURONATA

Študije biosinteze hialuronata lahko razdelimo v 3 faze. Prvi avtor in najvidnejši znanstvenik v prvi fazi je bil Albert Dorfman. Že v zgodnjih 50-ih je s sodelavci opisal izvor monosaharidov, ki so bili vgrajeni v hialuronske verige streptokokov. Leta 1955 sta Glaser in Brown prvič dokazala možnost sinteze hialuronata z ločenim sintetičnim sistemom zunaj celice. Uporabili so encim, izoliran iz celic piščančjega Rousovega sarkoma, in v sestavo hialuronskih oligosaharidov vnesli s 14C označeno UTP-glukuronsko kislino. Skupina Dorfman je prav tako izolirala prekurzorski molekuli UTP-glukuronske kisline in UTP-N-acetilglukozamina iz streptokoknega ekstrakta in tudi sintetizirala hialuronat, z uporabo encimske frakcije, izolirane iz streptokokov.

V drugi fazi je postalo jasno, da se mora hialuronat sintetizirati po drugačni poti kot glikozaminoglikani. Sinteza hialuronata, za razliko od sulfatiranih polisaharidov, ne zahteva aktivne sinteze beljakovin. Za to odgovorna sintaza se nahaja v protoplastni membrani bakterij in plazemski membrani evkariontskih celic, ne pa v Golgijevem aparatu. Sintetični aparat se domnevno nahaja na notranji strani membrane, saj se je izkazalo, da je neobčutljiv na učinke zunajceličnih proteaz. Poleg tega hialuronska veriga prodre skozi membrano, saj je izpostavljenost celic hialuronidazi povečala proizvodnjo hialuronat. V osemdesetih letih prejšnjega stoletja je bilo izvedenih več neuspešnih poskusov izolacije sintaze iz evkariontskih celic.

V zgodnjih 90. letih se je pokazalo, da hialuronat-sintaza je virulentni faktor za streptokoke skupine A. Na podlagi teh podatkov sta dve skupini avtorjev uspeli identificirati gen in lokus, odgovoren za sintezo hialuronske kapsule. Kmalu je bilo mogoče klonirati gen za to sintazo in ga v celoti sekvencirati. Homologni proteini, izolirani v zadnjih letih iz vseh vretenčarjev, so zagotovili dragocene informacije o njegovi strukturi. Pomembno področje raziskav je lahko preučevanje mehanizmov, ki uravnavajo aktivnost te sintaze.

METABOLIZEM IN RAZGRADNJA HIALURONATA

Odkritje hialuronata v krvi in njegov transport iz tkiv skozi limfni sistem je postalo osnova za skupno študijo, ki sta jo vodila dr. Robert Fraser v Melbournu in laboratorij v Uppsali. Po dajanju kuncem in ljudem so v krvi našli sledi tritijevega acetil označenega polisaharida, oznaka spojine pa je izginila z razpolovno dobo nekaj minut. Kmalu je postalo jasno, da se večina sevanja nakopiči v jetrih, kjer se polimer hitro razgradi. Voda, označena s tritijem, je bila odkrita v krvi po 20 minutah. Avtoradiogrami so pokazali, da je do kopičenja sevanja prišlo tudi v vranici, bezgavkah in kostnem mozgu. Frakcioniranje celic je tudi pokazalo, da je v jetrih prišlo do kopičenja predvsem v sinusnem endoteliju, kar so pozneje potrdile študije in vitro in radiografija in situ. Te celice imajo receptor za endocitozo hialuronata, ki se bistveno razlikuje od drugih proteinov, ki vežejo hialuronat. Polisaharid se nato razgradi v lizosomih. Študije hialuronata so bile izvedene v drugih tkivih in zdaj obstaja popolna slika presnove tega polisaharida.

Pred kratkim še en vidik katabolizma hialuronat je postalo predmet številnih raziskav. Iz dela Guntherja Kreila (Avstrija) in Roberta Sterna ter njegovih sodelavcev (San Francisco) so postale znane strukture in lastnosti različnih hialuronidaz. Ti podatki so postali osnova za študije, ki so razjasnile biološko vlogo teh encimov.

HIALURONAT ZA RAZNE BOLEZNI

Že od vsega začetka je bilo zanimanje znanstvenikov usmerjeno v lastnosti hialuronata v sklepni tekočini, predvsem v spremembe njegove ravni pri boleznih sklepov. Pokazalo se je tudi, da je prekomerna proizvodnja hialuronata opažena pri številnih boleznih, na primer pri malignih tumorjih - mezoteliomih, vendar v tistem času ni bilo dovolj natančnih in občutljivih metod za odkrivanje hialuronata. To stanje je trajalo do osemdesetih let prejšnjega stoletja, ko so se razvile nove analitične tehnike, ki so ponovno pritegnile znanstveno zanimanje za nihanja v vsebini hialuronat za razne bolezni. Vsebnost hialuronata v krvi je bila določena v normalnih in patoloških stanjih, zlasti pri cirozi jeter. Pri revmatoidnem artritisu se je vsebnost hialuronata v krvi povečala med telesno aktivnostjo, zlasti zjutraj, kar je pojasnilo simptom "jutranje togosti" v sklepih. Pri različnih vnetnih boleznih se raven hialuronata v krvi poveča tako lokalno kot sistemsko. Motnje v delovanju organov bi lahko razložili tudi s kopičenjem hialuronata, ki je povzročil edem intersticijskega tkiva.

KLINIČNA UPORABA

Za glavni preboj v medicinski uporabi hialuronata je v celoti zaslužen dr. Balazs. Razvil je osnovne principe in ideje, prvi je sintetiziral obliko hialuronata, ki so jo bolniki dobro prenašali, spodbujal idejo o industrijski proizvodnji hialuronata in populariziral idejo o uporabi polisaharidov kot zdravil.

V 50. letih se je Balazs osredotočil na preučevanje sestave steklastega telesa in začel izvajati poskuse z nadomestki za možno protetiko pri zdravljenju odstopa mrežnice. Ena najresnejših ovir za uporabo hialuronskih protez je velika težava izolacije čistega hialuronata, brez vseh nečistoč, ki povzročajo vnetno reakcijo.

Balazs je rešil ta problem in nastalo zdravilo se je imenovalo NVF-NaGU (nevnetna frakcija hialuronat natrij). Leta 1970 so hialuronat prvič vbrizgali v sklepe dirkalnih konj, obolelih za artritisom, in dosegli klinično pomemben odziv na zdravljenje z zmanjšanjem simptomov bolezni. Dve leti pozneje je Balazsu uspelo prepričati vodstvo Pharmacie AB v Uppsali, da je začela proizvajati hialuronat za uporabo v klinični in veterinarski praksi. Miller in Stegman sta po nasvetu dr. Balazsa začela uporabljati hialuronat v intraokularnih lečah za vsaditev in hialuronat je hitro postal ena najpogosteje uporabljenih komponent v kirurški oftalmologiji ter prejel trgovsko ime Healon®. Od takrat so bile predlagane in preizkušene številne druge uporabe hialuronata. Njegovi derivati (na primer navzkrižno strukturirani hialuronati) so bili testirani tudi za klinično uporabo. Posebej želim poudariti, da je Balazs že leta 1951 poročal o biološki aktivnosti prvih takrat pridobljenih derivatov hialuronata.

ZAKLJUČEK

V tem poročilu smo uspeli zajeti le glavne in najpomembnejše dogodke v zgodovini raziskav hialuronata, veliko drugih zanimivih dejstev in podatkov pa bomo obravnavali na naši spletni strani. Iz predstavljenih člankov bo razvidno, da postajajo raziskave hialuronata vse bolj aktualne in potrebne. Danes je letno objavljenih od 300 do 400 člankov v znanstveni literaturi o hialuronat.

Prva mednarodna konferenca, v celoti posvečena hialuronatu, je bila leta 1985 v Saint-Tropezu, sledili so kongresi v Londonu (1988), Stockholmu (1996) in Padovi (1999).

Rast zanimanja je v veliki meri posledica uspešnega dela Endreja Balazsa, ki je veliko naredil na področju raziskovanja lastnosti hialuronata, pridobil prve podatke o njem in opozoril na možnost klinične uporabe. hialuronat in je navdih, ki potiska znanstveno skupnost k novim raziskavam.