Як виробляють гіалуронову кислоту. Будова та застосування в медицині гіалуронової кислоти. Серед основних відносяться

1.Історія відкриття

2.Фізико-хімічні властивості ГК

3.Біологічна роль ГК

4.Синтез та метаболізм ГК в організмі людини

5.Отримання та модифікація ГК

6. Активні біологічні функції ГК в організмі людини

7. Застосування ГК у косметології та пластичній хірургії

8. Ін'єкційні методики введення гіалуронової кислоти та їх ускладнення

1.Історія відкриття

Гіалуронова кислота(гіалуронат, гіалуронан) (ГК) - несульфований глікозаміноглікан, що входить до складу сполучної, епітеліальної та нервової тканин. Є одним з основних компонентів позаклітинного матриксу, що міститься в багатьох біологічних рідинах (склоподібному тілі, синовіальній рідині та ін.). Назва «гіалуронова кислота» цій речовині було дано в 1934 К. Мейєром. Хімічна структура гіалуронової кислоти (була встановлена ​​у 1950-х роках К. Мейєром та Дж. Палмером, які вперше ідентифікували його зі склоподібного тіла ока. .

2.Фізико-хімічні властивості ГК

Гіалуронова кислота являє собою полімер, що складається з залишків D-глюкуронової кислоти та D-N-ацетилглюкозаміну, поєднаних по черзі β-1,4- і β-1,3-глікозидними зв'язками. Молекула ЦК може містити до 25 00 таких дисахаридних ланок. Природна ГК має молекулярну масу від 5 до 20 000 кДа, також продукується деякими бактеріями (напр. Streptococcus) [Маррі Р. та ін., 2009], проте не існує у вільному стані, тільки у вигляді солей Na, Ca та ін., тому говорячи про ЦК, завжди мається на увазі якась її сіль.

3.Біологічна роль ГК

Навіть 1% розчин ГК має помітну в'язкість, оскільки її молекули утворюють у воді щось на кшталт сітки. Недарма гіалуронову кислоту іноді називають молекулярною губкою [Сеньйор Жан-Марк, 1998]. Завдяки своїм фізико-хімічним властивостям (висока в'язкість, специфічна здатність зв'язувати воду та білки та утворювати протеогліканові агрегати) ГК сприяє прояву численних функцій сполучної тканини та є одним з основних компонентів позаклітинного матриксу, склоподібного тіла ока та синовіальної рідини. [Будівельників Ст., Федорищев І., 2000].

Дослідження ГК показали, що унікальність цієї речовини полягає також і в тому, що молекули ДК з різною довжиною полісахаридного ланцюга мають різні ефекти на клітинну поведінку:

— Короткі ланцюги ГК(з мол. масою менше 30000) мають протизапальну дію;

— Середньомолекулярна ГК(з мол. масою більше 500000) пригнічує ангіогенез, інгібує клітинну міграцію та проліферацію, а також продукцію інтерлейкіну-1b та ​​простагландину Е2, внаслідок чого вона знайшла широке застосування в офтальмології та лікуванні посттравматичних та дегенеративних артритів;

— Високомолекулярна фракція ГКз мол. масою 50000-100000 має здатність стимулювати клітинну міграцію і проліферацію в шкірних покривах, а також має велику водоутримуючу здатність. Одна молекула високомолекулярної фракції ГК пов'язує до 500 молекул води.Тому дерма, що містить значну кількість ГК, оптимально насичена водою, що забезпечує шкірі пружність та стійкість до зовнішніх впливів.

4.Синтез та метаболізм ГК в організмі людини

На відміну від інших глікозаміногліканів, що синтезуються в апараті Гольджі, ГК синтезується на внутрішній поверхні плазматичної мембрани. У міру подовження полімерного ланцюга ГК виводиться через мембрану на її зовнішню поверхню. Поза клітинами ГК може утворювати комплекси з гіалуронат-зв'язуючими білками, званими гіалатгеринами.

Усі гіаладгерини містять у своєму складі гіалуронат-зв'язуючий мотив або протеоглікановий тандемний повтор (PTR) у вигляді однієї (CD44 та TSG-6) або двох (вернікан, сполучний білок, аггрекан, нейрокан, бревікан) копій. Різні тканини містять різні набори гіаладгеринів, що з особливостями структури і функціями конкретної сполучної тканини. Так, у хрящі виявлено аггрекан і сполучний білок, тоді як у більш м'якій сполучній тканині дерми – верзикан.

Синтез гіалуронату здійснюється ферментом гіалуронатсинтазою. У людини є три гіалуронатсинтази HAS1, HAS2 та HAS3. Вони кодуються різними генами, які локалізовані різних хромосомах і походять від загального предка. Кожен із синтезованих HAS-білків (гіалуронатсинтаз) може відігравати специфічну роль у біосинтезі гіалуронату:

— HAS1-білокздійснює повільний синтез високомолекулярного гіалуронату;

— HAS2-білокзначно активніший, ніж HAS1 і також синтезує високомолекулярний гіалуронат (до 2 х 106 Da);

— HAS3-білокнайбільш активний із трьох HAS-білків, але синтезує більш короткі ланцюги гіалуронату ((2-3) х 105 Da).

Молекули гіалуронату різної довжини по-різному впливають поведінка клітин. Можливо, це відіграє у механізмах фізіологічної регуляції.

ГК деградується під впливом групи тканинних ферментів, які називаються гіалуронідазами. Продукти розкладання ГК (олігосахариди і вкрай низькомолекулярні гіалуронати) виявляють проангіогенні властивості (стимулюють утворення нових капілярів з вже існуючих судин. Крім того, недавні дослідження показали, що фрагменти ГК, на відміну від нативного високомолеколекулярного полісахариду, здатні індукувати. при ушкодженнях тканин та відторгненні трансплантованої шкіри У тілі людини вагою 70 кг у середньому міститься близько 15 грамів ГК, третина з якої перетворюється (розщеплюється або синтезується) щодня.

5.Отримання та модифікація ГК

Для практичних цілей у медицині та косметології, ГК виділяється з різних біологічних тканин – склоподібне тіло тварин, синовіальна рідина, пупкові канатики, оболонок різних штамів мікроорганізмів тощо. Основним та найперспективнішим джерелом отримання ГК є гребені птахів.

Не менш важливим завданням є очищення екстрактів ГК від чужорідних білкових фракцій і нуклеїнових кислот та подальше надання препарату потрібних властивостей за допомогою його модифікації, що забезпечує її реологічні та в'язкопружні властивості, а також збільшення опору деградації під дією ферментів організму та зовнішніх факторів. Подібна зміна властивостей ГК розширює сфери застосування як компонент різних препаратів та лікарських субстанцій.

Один із способів модифікації забезпечується фотополімеризацією або фотоперехресним зшиванням молекул гіалуронової кислоти під впливом квантового/лазерного випромінювання певних довжин хвиль від 514 до 790 нм.

6. Біологічні функції ГК в організмі людини

Регенеруюча:Посилення міграції та секретуючої здатності фібробластів

Протизапальна:Поліпшення мікроциркуляції крові

Протимікробна:Активація бактерицидних факторів на поверхні шкіри та ранових поверхнях

Протитоксична:Зниження показників ендогенної інтоксикації

Імуномодулююча:Посилення фагоцитозу, зміна активності лімфоцитів

Антиоксидантна:Акцептування активних форм кисню, блокуючи вільнорадикальне окислення ліпідів.

Гемостатична:Активація компонентів гемостазу з утворенням тромбу

Завдяки своїм унікальним властивостям, ГК, як монотерапія або в комбінованій синергії з квантофорезом та іншими фізіотерапевтичними факторами (електрофорез, іонофорез, магнітотерапія та ін.) знаходить широке застосування в лікувальних та реабілітаційних програмах різних областей медичної практики та косметології. медицини, хірургії, гінекології, неврології, урології, дерматології, естетичної медицини тощо.

7. Застосування ГК у косметології та пластичній хірургії

У шкірі наявність гіалуронової кислоти вперше показано К. Меєром у 1948 році. До теперішнього часу встановлено, що шкіра (як епідерміс, так і дерма) належать до тканин з найбільшим вмістом гіалуронату, який багато в чому визначає не тільки структуру, а й захисні та регенераційні властивості шкірного покриву.

Гіалуронова кислота – натуральний зволожувач та каркас шкіри.

У дермі ГК утворює каркас, до якого приєднуються інші глікозаміноглікани (і насамперед хондроїтинсульфат) і білки, звані за їх властивість вибірково зв'язуватися з ГК гіалатгеринами, з утворенням полімерної мережі, яка заповнює велику частину позаклітинного простору, забезпечуючи механічну молекул та міграцію клітин. З іншого боку, в епідермісі ГК локалізується у навколоклітинному просторі, створюючи оболонку клітини, яка захищає її від дії токсичних речовин.

Слід зауважити, що тільки фракція ГК з молекулярною масою 50000-100000 має здатність стимулювати клітинну міграцію і проліферацію в шкірних покривах, а також має найбільш можливий рівень водоутримуючої здатності. Одна молекула високомолекулярної фракції ГК пов'язує до 500 молекул води. Тому шкірні покриви, що містять значну кількість ГК, максимально насичені водою, що забезпечує шкірі пружність та стійкість до зовнішнього впливу.

Однією з головних ознак старіння шкіри є зниження вмісту ГК та тісно пов'язане з цим скорочення запасу вологи у шкірі. Найбільша кількість гіалуронової кислоти міститься у сполучній тканині новонароджених дітей. До 30-35 років кількість ГК в дермі залишається досить стабільним, після - починає досить швидко знижуватися, про що сигналізують ознаки біологічного старіння, що з'являються в цей час - втрата вологості, погіршення еластичності і тонусу шкіри, поява зморшок.

Крім того, з віком знижується власний синтез гіалуронової кислоти в дермі та епідермісі та прискорюється її руйнування під дією різних зовнішніх та внутрішніх факторів [Сеньйор Жан-Марк, 1998].

Завдяки своїм унікальним властивостям, ГК знаходить широке застосування у різних галузях медичної практики та косметології.

Величезною популярністю нині користуються процедури, спрямовані на омолодження шкіри обличчя, рук та інших відкритих частин тіла та усунення видимих ​​ознак старіння шляхом внутрішньошкірного введення ГК, яке називається гіалуроновою біоревіталізацією (гіалуропластикою), тобто відновлення кількості ГК у шкірі властивого молодому віку.

8. Ін'єкційні методики введення гіалуронової кислоти та їх ускладнення.

Традиційною формами подібного поповнення є спосіб ін'єкційного введення гіалуронової кислоти в шкіру, що має низку недоліків та ускладнень, які залежать від багатьох зовнішніх та внутрішніх факторів, у тому числі пов'язаних з помилками персоналу, індивідуальними особливостями та підвищеною чутливістю шкіри до алергенної природи препарату, що потрапляє в кров. а також наявністю супутніх захворювань та протипоказань.

До найпоширеніших ускладнень ін'єкційного введення ЦК належать:

— опухання, виражені гранулематозні реакції, різного ступеня набряку та еритема в місцях ін'єкції внаслідок реакцій локальної гіперчутливості за типом ангіоневротичного набряку, які можуть зберігатися протягом тривалого часу і мати негативні естетичні наслідки;

— після ін'єкційного введення ГК часто виникає рецидив герпетичних висипань, внаслідок стимуляції латентного вірусу герпесу, особливо в області губ;

- використання інфікованого чи погано очищеного препарату провокують розвиток інфекційних процесів шкіри чи реакції на чужорідні тіла;

- Зміни пігментації шкіри в області ін'єкції;

- шкірні запальні захворювання в зонах, що підлягають обробці, унеможливлюють ін'єкційну біоревіталізацію - наслідки можуть бути дуже негативними і провокувати дифузію запального процесу;

- Наявність ряду супутніх захворювань;

- ін'єкційна біоревіталізація при вагітності та при годівлі груддю також неприпустима;

- ускладнення після ін'єкційної біоревіталізації неминучі, якщо є алергія на компоненти препарату або аутоімунні захворювання;

- прийом антикоагулянтів (препаратів, що розріджують кров, наприклад ацетилсаліцилової кислоти в аспірині) також можуть стати причиною негативних наслідків ін'єкційної біоревіталізації;

- при підвищеній схильності до утворення келоїдних рубців не рекомендується ін'єкційна біоревіталізація, оскільки наслідки можуть бути непередбачуваними;

- маніпулюючи голкою, косметолог не в змозі повністю контролювати підшкірну область введення препарату та уникнути введення препарату в кровоносну судину, особливо в зоні очей. З іншого боку, занадто поверхневе введення препарату здатне викликати появу нерівностей поверхні шкіри, в той же час надмірно глибоке може виявитися нерезультативним;

- Болючість процедури;

- Економічний фактор і відносна дорожнеча процедури.

Всі ці негативні прояви методики ін'єкційного введення гіалуронової кислоти вдається уникнути при застосуванні альтернативної технології лазерофорезу (квантофорезу) КВАНТОЛУ.

Дана методика за своєю ефективності в косметології не поступається і навіть перевершує існуючий досі і найбільш поширений спосіб ін'єкційного введення гіалуронової кислоти в шкіру, що має ряд недоліків та ускладнень, що залежать від багатьох факторів, у тому числі пов'язаних з помилками персоналу, місцевими факторами шкіри, гіперчутливість шкіри, наявністю хронічних захворювань.

При цьому способі біоревіталізації досягається набагато більший і рівномірний розподіл гіалуронової кислоти в шкірі в порівнянні з ін'єкційними методиками.

По суті, технологія КВАНТОЛУ є поєднаною методикою фотодинамічного омолодження (біоревіталізації) шкіри та привертає увагу фахівців завдяки безпеці, ефективності, безболісності, відсутності небажаних побічних ефектів та доступності для широкого застосування.

У ширшому аспекті, крім цілей омолодження шкіри, цей метод може успішно використовуватися для лікування низки шкірних захворювань, наприклад фотоушкоджень шкіри, гіперплазії сальних залоз, вугрів і безлічі інших станів, з якими стикаються дерматологи і косметологи та ін. (Докладніше…)

1

Даний короткий історичний нарис про відкриття та комплексне вивчення гіалуронових кислот. У порівняльному плані проведено систематизацію даних наукової літератури щодо особливостей хімічної будови, фізико-хімічних властивостей, гістологічної та цитологічної приналежності, функцій та метаболізму гіалуронових кислот у організмів різних таксономічних груп. Виявлено особливості ферментного складу, що забезпечують синтез та деградацію біополімеру у мікроорганізмів та в клітинах тканин ссавців. Проаналізовано традиційні технології вилучення з тваринної сировини та способи її одержання на основі культур Streptococcus equi subsp. equi, S. equi subsp. zooepidеmisus та Bacillus subtilis. Обґрунтовано науково-технічну розробку інноваційних біотехнологій гіалуронових кислот різної молекулярної маси та перспективи їх виробничої реалізації. Наведено відомості про застосування продукції на їх основі у різних сферах сучасного життя.

гіалуронова кислота

технології мікробного синтезу

біотехнологія

бактерії

1. Білодєд А. В. Мікробіологічний синтез та деградація гіалуронової кислоти бактеріями р. Streptococcus: Автореф. дис. канд. біол. наук: МГУПБ – М., 2008. – 23 с.

2. Бичков С.М., Колесніков М.Ф. Спосіб отримання гіалуронової кислоти//A. з № 219752 СРСР, 1968. – Бюл. № 19. – С. 90.

3. Забненкова О.В. Внутрішньодермальні філери на основі гіалуронової кислоти. Показання до застосування, можливі комбінації // Пластична хірургія та косметологія: науково-практичний журнал, 2010. – № 1 – С. 101-115. URL: http://www.pscj.ru/upload/iblock/569/11.pdf (дата звернення: 24.11.2016)

4. Костіна Г., Радаєва І. Використання гіалуронової кислоти в медицині та косметології // Косметика та медицина, 1999. - № 2-3. – С. 53-57.

5. Лупина Т. П., Волошина Є. С. Мікробіологічний спосіб отримання гіалуронової кислоти та перспективи її використання у фармацевтиці. Національний університет харчових технологій, Україна. – 2014. – С. 4.

6. Препарати Princess filler та Princess volume у корекції вікових змін особи та атрофічних рубців // Ін'єкційні методи в косметології, 2013. - №2 /http://corneal.ru/events/publications/43/ (дата звернення: 24.11.2016 )

7. Португалова B.B., Ерзікян К.Л. Гіалуронова кислота та її роль у життєдіяльності організмів // Успіхи сучасні. біол., 1986. – Т. 101, № 3. – С. 344-358.

8. Радаєва І.Ф., Костіна Г.А., Зміївський A.B. Гіалуронова кислота: біологічна роль, будова, синтез, виділення, очищення та застосування // Прикл. біохім. мікробіол., 1997. – Т. 33, №2. – С. 133-137.

9. Ряшенцев В.Ю., Микільський С.Ф., Вайнермен Є.С. та ін. РФ, 1994. - Бюл. № 15. – С. 75-76.

10. Толстих П.І., Стекольников Л.І., Рильцев В.В. та ін. Лікарські препарати тваринного походження для зовнішнього застосування // Хім.-Фарм. журн., 1991. – Т. 25, № 4. – С. 83-87

11. Філери: що це таке [Електронний ресурс] // Стоматологія & косметологія http://24stoma.ru/filleri.html (дата звернення: 24.11.2016 р.)

12. Abatangelo G., Martinelli M., Vecchia P. Хіляння hyaluronic acid-enriched wounds:histological observations // J. Surg. Res., 1983. – V. 35, № 5. – P. 410-416.

13. Ahmet Tezel & Clenn H. Fredrickon Дермальні філери на основі гіалуронової кислоти: погляд з позиції науки [Каліфорнійський університет, Санта-Барбара, США] [Електронний ресурс] // SKIN AESTHETIC http://estetika.uz/upload/files/ .pdf (дата звернення: 24.11.2016)

14. Carter G.R. Pasteurellosis: Pasteurella multocida та Pasteurella hemolytica. // Adv. Vet. Sci., 1967. – V. 11. – P. 321-379.

15. DeAngelis P.L., Jing W., Graves M.V., Burbank D.E., van Etten J.L. Hyaluronan synthase о chlorella virus PBCV-1 // Science, 1997. - V. 278. - P. 1800-1803.

16. DeAngelis P.L., Papaconstantinou J., Weigel P.H. Isolation of Streptococcus pyogenes gene locus що прямі hyaluronan biosynthesis в acapsular mutants і в heterologous bacteria // J. Biol. Chem, 1993. – V. 268. – P. 14568-14571.

17. Frost G.I., Csoka Т., Stern R. The hyaluronidases: хімічний, біологічний і клінічний overview // Trends Glycosci. Glycotech., 1996. – V. 8. – P. 419-434.

18. Graves M.V., Burbank D.E., Roth R., Heuser J., DeAngelis P.L., van Etten J.L. Hyaluronan synthesis in virus PBCV-1-infected chlorella-like green algae // Virology, 1999. - V. 257. - P.15-23.

19. Karlstam В., Vincent J., Johansson В., Bryno C. А пряма purification метод шпильки krill для здобуття high levels of hydrolytic enzymes // Prep. Biochem., 1991. – V. 21. – P. 237-256.

20. Kendall F.E., Heidelberger M., Dawson M.H. A serologically inactive polysaccharide elaborated by mucoid strains of group A hemolytic Streptococcus. // J. Biol. Chem., 1937. – V. 118. – P. 61-69.

21. Kim JH, Yoo SJ, Oh D.K., Kweon Y.G. та ін. Виділення Streptococcus equi mutant і optimization culture conditions for production of high molecular weight hyaluronic acid. // Enzyme Microb. Technol., 1996. – V. 19. – P. 440-445.

22. Lansing M., Lellig S., Mausolf A., Martini I., Crescenzi F., Oregon M., Prehm P. Hyaluronate synthase: cloning and sequencing of gene from Streptococcus sp. / / Biochem. J., 1993. -V. 289. – P. 179-184.

23. Linker A., ​​Meyer K. Production of Unsaturated Uronides Bacterial Hyaluronidases //Nature, 1954. - V. 174. - P. 1192-1194.

24. Matsubara C, Kajiwara M., Akasaka H., Haze S. Carbon-13 nuclear magnetic resonance studies on biosynthesis of hyaluronic acid // Chem. Фарм. Bull., 1991. – V. 39. – P. 2446-2448.

25. Meyer K. Highly viscous sodium hyaluronate // J. Biol. Chem., 1948. – V. 176. – № 2. – P. 993-997.

26. Meyer K. Hyaluronidases // The Enzymes. – V. 5. / ed. Boyer P.D. - New York: Academic Press, 1971. - P. 307-320.

27. Meyer K., Palmer J. Polysaccharide of vitreous humor // J. Biol. Chem., 1934. -V. 107. – P. 629-634.

28. Mortimer E.A., Vastine E.L. Production of Capsular Polysaccharide (Hyaluronic Acid) L Colonies of Group A Streptococci. // J. Bacteriol., 1967. – V. 94, № 1. – P. 268-271.

29. Prehm P. Hyaluronan. //Біополімери: біологія, хімічна, біотехнологія, застосування. -V. 5: Polysaccharides I. Polysaccharides від prokaryotes. / eds. Vandamme E.J., DeBaets S., Steinbuchel A. - Weinheim: Wiley-VCH, 2000. - P. 379-404.

30. Prehm P. Synthesis of hyaluronate в різних тератоcarcinoma клітинах: characterization of the synthase. / / Biochem. J., 1983. – V. 211. – P. 181-189.

31. Roseman S., Moses F.E., Ludowieg J., Dorfman A. Biosynthesis hyaluronic acidby group A Streptococcus. Utilization of l-C14-glucose // J. Biol. Chem., 1953. – V. 203. – P.213-225.

32. Scott J.E., Cummings C, Brass A., Chen Y. Секційні структури hyaluronan в подібній рішучості, що вивчаються по ротації shadowing-electron microscopy and computer simulation. Hyaluronan is a very efficient network-forming polymer // Biochem. J., 1991. – V.274. – P. 699-705.

33. Shimada Е., Matsumura G.J. Molecular Weight of Hyaluronic Acid від Rabbit Skin //J. Biochem., 1977. – V. 81. – № l. – P. 79-91.

34. Stern R., Asari A.A., Sugahara K.N. Hyaluronan fragments: an information-rich system // Eur. J. Cell Biol., 2006. – V. 85. – P. 699-715.

35. Sugahara K., Schwartz N.B., Dorfman A. Biosynthesis Hyaluronic Acid by Streptococcus // J. Biol. Chem., 1979. – V. 254, № 14. – P. 6252-6261.

36. Weigel P.H., Hascall V.C., Tammi M. Hyaluronan Synthases // J. Biol. Chem., 1997. – V. 272, № 22. – P. 13997-14000.

37. Widner Ст, Behr R., Von Dollen S., Tang M., Неї Т., Sloma A., Sternberg D., DeAngelis P.L., Weigel PH, Brown S. Hyaluronic Acid Production в Bacillus subtilis // Appl. Environ. Microbiol., 2005. – V. 71, № 7. – P. 3747-3752.

A DESCRIPTION OF DIFFERENT METHODS USED TO OBTAIN HYALURONIC ACID

Савоскін О. В. 1 Семіонова Е. Ф. 1 Рашевская Е. Ю. 1 Полякова А. А. 1 Грибкова Е. А. 1 Агабалаева К. О. 1 Моісєва I. Ya. 1

1 Penza State University

Abstract:

Матеріал дає brief історичний випадок discovery і сприятливого вивчення hyaluronic acids. Виникає і систематизує природничі фокуси, спрямовані на специфічні особливості функцій, metabolism, хімічна конституція, фізичні, хімічні, історичні і цитологічні властивості hyaluronic acids in organisms belonging to different taxonomic groups. We also reveal the specific features of enzyme composition that ensure the synthesis and degradation of biopolymers in microorganisms and mammals’ tissue cells. В додатку, ми analyze traditional extraction technology used with animal-based raw materials and ways obtaining them from Streptococcus equi subsp. equi, S. equi subsp. zooepidemisus and Bacillus subtilis. Крімбільше, існують люди для наукового і технічного розвитку інноваційних біотехнологій, пов'язаних з hyaluronic acids with different molecular weight and their production prospects. Finally, we give information o how hyaluronic acid-based goods are used in different spheres of modern life.

Keywords:

технології microbial synthesis

В останні роки медицина, фармацевтика і косметологія далеко зробили крок у питанні використання високомолекулярних сполук (ВМС), як основних діючих, а також допоміжних, коригуючих речовин і наповнювачів. Одним з найбільш затребуваних в медицині та косметології ВМС на сьогоднішній момент, є гіалуронова кислота (ГК), яка знайшла своє застосування в хірургії, як замінник синовіальної рідини в суглобах як змащувальний та хондропротекторний компонент; дерматології, як ремоделюючий агент при корекції вікових деформацій шкіри обличчя, особливо шкіри навколо очей; гінекології, як протиспайковий засіб при внутрішньопіхвових зрощеннях. Таким чином, спектр застосування гіалуронової кислоти дуже широкий; він постійно поповнюється, що призводить до підвищення попиту на даний вид біополімеру, а отже інтересу до альтернативних джерел його отримання.

1. Історія відкриття гіалуронової кислоти

У 1934 р. в журналі Journal of Biological Chemistry була опублікована стаття Карла Маєра і Джона Палмера, в якій згадувався незвичайний полісахарид, виділений зі склоподібного тіла бичачого ока (від грец. hyalos — склоподібний і англ. молекулярної маси 450 г/моль і не містить сульфатних груп. Подальші дослідження показали, що полісахарид представлений фрагментами дисахариду, що складається з D-глюкуронової кислоти та N-ацетильованого глюкозоаміну.

Дані про належність біополімеру лише структурам організмів ссавців спростували, коли в 1937 р. Кендал і Хейдельбергер заявили про виділення полісахариду ідентичного гіалуронану з культуральної рідини гемолітичного стрептокока. Ідентичність виділеного біополімеру підтвердилася ними пізніше після встановлення структури полісахариду в 60-ті роки. У 1954 р. у журналі Nature керівник лабораторії Meyer опублікував структурну формулу фрагмента дисахариду, продукту розщеплення стрептококової гіалуронатліази.

Науковий інтерес до гіалуронової кислоти, її отримання, виділення та застосування все більше збільшувався. На сьогодні опубліковано понад 15000 статей у зарубіжних та вітчизняних журналах. Результатом досліджень було отримання достовірних даних про виділення гіалуронану з різних органів ссавців, а також культур різних клітин (гемолітичний стрептокок, стрептоміцети, коринебактерії). Деякі дані мали промислове значення, наприклад, екстракція гіалуронової кислоти з гребенів курей використовується і зараз. За півстоліття збільшився і спектр застосування гіалуронану (хірургія, косметологія, травматологія та ортопедія, дерматологія та ін.), а також були створені новітні лікарські форми на основі полімерної структури. Все це було неможливо без встановлення біологічної ролі біополімеру, який, як виявилося, служив компонентом клітинного матриксу, необхідного для нормального здійснення метаболічних процесів проліферації та диференціації тканин. Так було вивчено процес метаболізму гіалуронану в організмі людини. Стало відомо, що в день розпадається та синтезується близько 5 г гіалуронової кислоти, а її вміст у тілі людини становить приблизно 0,007%, що становить близько 15 г у жінки масою 70 кг.

У 1953 р. Роземан, Мозес і Дорфман опублікували роботи, де було вказано спосіб отримання гіалуронану, його осадження та виділення у вільному вигляді на основі культур гемолітичного стрептокока. Надалі їх методи виділення та осадження були вдосконалені Цифонеллі та Маєдо, що дозволило підвищити вихід та чистоту продукту. Механізм утворення гіалуронану в бактеріях, у тому числі стрептококів, був виявлений пізніше, коли було досліджено ферментний склад мікроорганізмів, здатних до синтезу гіалуронової кислоти. У 1959 р. було доведено існування специфічних пептидів гіалуронатсинтетаз, які здійснюють синтез полісахариду у мембранах бактерій.

У 1992 р. американські вчені заявили про клонування гена, що відповідає за синтез гіалуронатсинтетази, і передачу його штаму кишкової палички. Проте активного ферменту здобути не змогли. ДеАнгеліс у 2002 р. повідомив про успішне виділення оперону гіалуронатсинтетази та експресію його в мікроорганізм. Це був перший випадок клонування глюкозоаміноглікансинтетаз у світовій практиці.

В даний час у світі проводяться дослідження механізмів дії гіалуронових кислот, їх ролі в організмі людини та альтернативних шляхів використання. Однак особливо актуальними є питання мікробного синтезу гіалуронану, що підтверджує ціна за кілограм очищеного продукту, що становить близько 700000 т. руб. (Імпортований продукт на основі тваринної сировини). Так, за останні 20 років у світі було видано понад 50 патентів, що свідчить про високий інтерес до цієї проблеми.

2. Хімічна будова та фізичні властивості гіалуронової кислоти

Близько 20 років з моменту першої публікації про відкриття тваринного полісахариду гіалуронової кислоти (1934 р.) знадобилося лабораторії Meyer для встановлення точної хімічної будови гіалуронової кислоти. Гіалуронова кислота, гіалуронат або гіалуронан - (C14H21NO11)n - органічна сполука, що відноситься до групи несульфатованих глюкозоаміногліканів (рис. 1). Наявність численних сульфатованих груп у споріднених глюкозоаміногліканів є причиною численної ізомерії, чого не спостерігається у гіалуронової кислоти, яка завжди хімічно ідентична, незалежно від методів та джерел одержання. Молекула гіалуронової кислоти побудована з повторюваних фрагментів D-глюкуронової кислоти та N-ацетил-D-глюкозоаміну, з'єднаних β-(1-3)глікозидним зв'язком. Основи фрагментів цукрів - це глюкопіранозне кільце з різними замісниками (ацетамідна група, гідроксильні та карбоксильні функціональні групи).

Мал. 1. Хімічна формула гіалуронової кислоти

Для молекули гіалуронової кислоти характерне утворення великої кількості водневих зв'язків як усередині молекули, так і між сусідніми вуглеводними залишками, що знаходяться на значній відстані, а у водному розчині навіть між сусідніми молекулами через карбоксил і ацетамідну групу. Має кислу реакцію середовища через наявність непротонованої карбоксильної групи. Кислотні властивості гіалуронату дозволяють одержувати розчинні у воді солі з лужними металами. Гіалуронова кислота - це аніонний лінійний полісахарид із різною молекулярною масою 105-107Так. Молекулярна маса залежить від способу отримання, причому, через відсутність ізомерії, гіалуронат, що отримується, завжди хімічно ідентичний стандартному.

Розчини гіалуронової кислоти 1-4% утворюють псевдогелі. У водному середовищі сила кислотності карбоксильної групи (pK) становить близько 3-4, тому, для збереження електронейтральності в розчині, молекулу оточують позитивно заряджені катіони металів, Na+, K+, Мg2+ та Ca2+, що призводить до формування міцної структури гелю з великим вмістом води . З важкими металами та барвниками дає нерозчинні у воді комплекси. Крім того, гіалуронат специфічно реагує з білками і в результаті дає нам складні гелеподібні комплекси, які нерідко випадають в осад.

У водному розчині гіалуронова кислота має досить великі значення поздовжнього розміру полісахаридного ланцюга - приблизно 1 нм, тому, перебуваючи в організмі ссавців, гіалуронова кислота набуває найбільш компактної форми. За допомогою рентгеноструктурного аналізу з'ясовано, що гіалуронат може формувати ліву ординарну та подвійну спіралі, різні багатониткові плоскі структури, а також надспіралізовані структури з варіаціями концентрацій у різних частинах ланцюга, що формують щільну молекулярну сітку, що і становить вторинну структуру полісахари. Це в основному обумовлюється утворенням водневих зв'язків, зв'язуванням з катіонами лужних металів та гідрофобними взаємодіями. Третинна структура гіалуронової кислоти - це сітка, що володіє високими реологічними властивостями (домени відштовхуються один від одного), здатна поглинати значну кількість води та електролітів, а також великі молекули білків, проте точно певного розміру пор третинна структура не утворює. Мережі мають дуже чітку впорядкованість, зважаючи на наявність електронних ефектів за функціональними групами та замісниками. При цьому молекула приймає найбільш енергетично вигідне становище, яке також залежить від іонного оточення.

3. Гіалуронова кислота в природі, функції гіалуронату залежно від гістологічної та цитологічної приналежності у різних організмів

Наявність гіалуронатсинтетаз та гіалуронових кислот у капсулах вірусів та бактерій пологів Streptococcus можна пояснити, як адаптативний еволюційний пристрій, який бактерії та віруси запозичили у вищих тварин, тим самим збільшивши свою здатність долати імунну відповідь господаря.

3.1 Гіалуронова кислота в тканинах ссавців

Гіалуронат – основний компонент міжклітинного матриксу різних тканин ссавців, проте розподілений нерівномірно. Так, наприклад, максимальна концентрація вмісту гіалуронової кислоти в тілі людини спостерігається в синовіальній рідині, пупковому канатиці, склоподібному тілі ока та шкірі.

У шкірі глюкозоаміноглікан міститься в інтерстиціальному просторі та виконує ряд функцій: утримує воду, тим самим підтримує природну еластичність та об'єм шкіри, що так важливо при запальних реакціях; бере участь у процесах проліферації та диференціації кератиноцитів та імунокомпетентних клітин, тим самим відіграє роль у підтримці нормального процесу росту та регенерації шкірних покривів та здійсненні місцевого імунітету, зміцнює волокна колагену (рис. 2); служить природним бар'єром, що захищає від дії вільних радикалів, хвороботворних агентів та хімічних речовин.

Мал. 2. Вплив гіалуронової кислоти на колагенові волокна.

При нестачі природної гіалуронової кислоти, наприклад, при старінні або захворюваннях шкіри, розвиваються дегенеративні порушення: знижується місцевий імунітет, ранозагоювальна здатність, еластичність шкіри, що веде до виникнення зморшок. У хрящовій тканині ГК виконує функцію структурного елемента матриксу, необхідного для зв'язування та утримання хондроїтинсульфатпротеоглікана для зміцнення колагенового каркасу хряща. У синовіальній рідині гіалуронат забезпечує мастило для рухомих частин суглоба, зменшуючи їх знос. При запальних захворюваннях суглобів (артритах) знижується кількість гіалуронової кислоти, зменшується в'язкість синовіальної рідини, що веде до погіршення руху. Також гіалуронова кислота відіграє важливу роль в ембріогенезі, є передавачем сигналів клітинної рухливості.

Таким чином, функції гіалуронату дуже великі, і в міру подальшого розширення сфери вивчення її властивостей, будуть відкриватися нові факти про роль глюкозоаміноглікану в організмі людини і ссавців.

3.2 Гіалуронова кислота як компонент капсул бактерій

4. Метаболізм гіалуронової кислоти

Синтез гіалуронової кислоти досить добре вивчений. Для ссавців та бактерій пологів Streptococcus та Pasteurella біохімія процесу принципово не відрізняється. Для синтезу гіалуронової кислоти необхідні компоненти полімеру: глюкуронова кислота та N-ацетилглюкозамін. Глюкуронова кислота синтезується за допомогою ряду ферментативних реакцій із глюкозо-6-фосфату (рис. 3).

Мал. 3. Схема синтезу глюкозоаміногліканів

Глюкозо-6-фосфат під дією ферменту -фосфоглюкомутази ізомеризується в глюкозо-1-фосфат. Далі фермент УДФ-глюкозопірофосфорилази каталізує утворення УДФ-глюкози з уридиндифосфату та глюкози. Після відбувається ферментзалежне окислення гідроксогруп УДФ-глюкози під дією ферменту УДФ-глюкозодегідрогенази. Результат – утворення глюкуронової кислоти.

N-ацетилглюкозамін синтезується із фруктозо-6-фосфату. При біосинтезі аміносахара відбувається перенесення аміногрупи на фруктозо-6-фосфат. Донор аміногрупи – глютамін, фермент амідотранфераза. Результат - утворення глюкозаміну-6-фосфату, який ізомеризується мутазою в глюкозамін-1-фосфат, який піддається ацетилюванню за участю ферменту ацетилтрансферази в присутності КoA до N-ацетилглюкозамін-1-фосфату, який необхідно активувати. -Фосфату. Це енерговитратний процес.

Останньою стадією синтезу гіалуронової кислоти буде здійснення глікозидтрансферазної реакції за допомогою єдиного ферменту гіалуронатсинтетази. Цей процес також відбувається з витратою енергії АТФ (на синтез 1 моля гіалуронату витрачається 2 моль АТФ).

4.1. Гіалуронатсинтетази: будова, функції, локалізація, кінетичні характеристики та механізми каталізу

Гіалуронатсинтетаза - металопротеїн молекулярної маси 49 кДа, фермент, що вимагає катіони металів для координації з фосфатними групами (активації) і використовує глюкозідфосфати як субстрати. Є єдиним у своєму роді ферментом, що каталізує синтез гіалуронової кислоти в організмі ссавців та в клітинній стінці гемолітичного стрептокока, а також у вірусу PBCV-1 та бактерії Pasteurella multicida. Дослідження, проведені в 50-і роки, в лабораторії Meyer дозволили встановити характерні особливості ферменту гіалуронатсинтетази: функціонує при нейтральних значеннях pH, для каталізу вимагає активовані за допомогою кон'югації з уридиндифосфатом глюкуронову кислоту і N-ацетилгонко2+ тних груп. Фермент виявляє високу активність у присутності кардіопіна (перебуває у комплексі). Тип 1 був вивчений в 1983-1998 р. Prehm і Asplund, характерний для гемолітичного стрептокока ссавців: гіалуронатсинтетаза синтезує гіалуронову кислоту за допомогою приєднання вуглецевих залишків до відновлювального кінця гіалуронату і (1-3 .

4.2. Ферменти, що здійснюють деполімеризацію гіалуронової кислоти

Катаболічні реакції гіалуронової кислоти ґрунтуються на ферментативному каталізі за допомогою гіалуронатлітичних ферментів. Гіалуронатліази були класифіковані у 1971 році в лабораторії Meyer. Концепція даної класифікації гранично проста: фермент - реакція, що каталізується, - продукт реакції. Відповідно до даної класифікації виділяють три різні види гіалуронідаз (гіалуронатліаз):

Гіалуроноглюкозамінідази (гіалуронідази ссавців) - ендо-β-N-ацетилгексоамінідази, розщеплюють гіалуронову кислоту до тетра-і гексасахаридів.

Гіалуроноглюкозамінідази не мають субстратної специфічності, а також здатні формувати поперечні зшивки між молекулами гіалуронату та хондроїтинсульфату. Однією з додаткових функцій гіалуронідазу в організмі ссавців є розщеплення гіалуронату до дисахарів для отримання енергії.

Гіалуронатліази (гіалуронідази бактерій) - це ендо-β-ацетил-гексоаміноелімінази, що гідролізують гіалуронат до 4,5-ненасичених дисахарів. Мають високу специфічність до субстрату. У бактерій гіалуронідази є фактором патогенності, необхідної для інвазії та адгезії бактерій (для проникнення в організм ссавця).

5. Отримання гіалуронової кислоти

Всі відомі способи одержання гіалуронової кислоти можна розділити на дві групи: фізико-хімічний метод, який полягає в екстрагуванні гіалуронату з тканин тваринної сировини ссавців, інших хребетних тварин та птахів; та мікробний метод отримання ГК на основі бактерій-продуцентів

5.1. Фізико-хімічний спосіб: екстракція з тваринної сировини

Як було сказано раніше, гіалуронова кислота зустрічається в багатьох тканинах ссавців та птахів, і, залежно від гістологічної приналежності, вміст гіалуронової кислоти та її молекулярна маса можуть змінюватись. Крім того, у різних тканинах гіалуронат може знаходитися в комплексах з білками та спорідненими полісахаридами, що ускладнює його очищення з подальшим виділенням. В даний час для промислового отримання використовують пупкові канатики новонароджених та гребені курей. Однак, крім перерахованих вище методів, описані різноманітні способи виділення гіалуронату на основі склоподібного тіла очей великої рогатої худоби, синовіальної рідини, суглобових сумок, свинячої шкіри, плазми крові та хрящової тканини. При виділенні біополімеру вдаються до різних прийомів виділення: гомогенізація, екстракція, фракційне осадження тощо.

Будь-яка процедура виділення гіалуронану включає попереднє руйнування органів і тканин, що містять біополімер, та білково-вуглеводних комплексів. Руйнування досягається за допомогою методів подрібнення та гомогенізації. Після одержаний гомогенат піддають екстракції з використанням водно-органічних розчинників. Ковалентно-пов'язані домішки пептидів видаляють методом ферментативного протеолізу, шляхом обробки протеазами (папаїном) або хімічною денатурацією (хлороформ, аміловий спирт з етанолом). Наступний етап - це адсорбція на активованому вугіллі, за допомогою електродіалізу. Від домішок мукополісахаридів біополімер очищають методом осадження хлоридом цетирпіридинію або іонообмінною хроматографією.

Найбільшого поширення, внаслідок доступності сировини та високого вмісту біополімеру, набув метод виділення гіалуронової кислоти з півнячих гребенів. Екстракція проводиться сумішшю ацетону з хлороформом (видалення білка), водою, або водно-спиртовою сумішшю (пропіоновий, трет-бутиловий спирти) з подальшою сорбцією на активованому вугіллі, за допомогою електрофорезу або на іонообмінній смолі.

5.2. Мікробний синтез, продуценти гіалуронової кислоти

Економічно вигіднішим є метод мікробного синтезу гіалуронової кислоти на основі бактеріальних штамів-продуцентів. Такий синтез при введенні його в масштаби виробництва матиме менше витрат, таких як витрати на тваринну сировину та залежність від сезонних поставок. І, навпаки, виробництво гіалуронану на основі мікробного синтезу дозволить масштабувати виробництво і отримати продукт високого ступеня очищення, що не містить домішок, а отже має низьку алергенність. З моменту відкриття здатності бактерій до синтезу гіалуронової кислоти, постійно ведуться дослідження можливості отримання полімеру біотехнологічним шляхом, тобто шляхом культивування бактерій-продуцентів на поживних середовищах певного складу в строго заданих умовах з подальшим виділенням цільового продукту. До продуцентів гіалуронану можна віднести капсулоутворюючі бактерії пологів Streptococcus і Pasteurella. До штамів-продуцентів висувається низка вимог:

Відсутність патогенності та, особливо, гемолітичної активності;

Здатність до синтезу високомолекулярної гіалуронової кислоти;

Великі розміри капсул з високим вмістом біополімеру (капсули повинні легко відокремлюватися, бажано при екстракції);

Відсутність гіалуронідазної активності, щоб виключити втрати цільового продукту;

Висока здатність до зростання, при цьому найповніше використання субстрату;

Збереження стабільності фізіолого-біохімічних властивостей.

Дослідження в області пошуку штаму, здатного задовольнити потреби в біополімері та відповідного всім параметрам, призвели до Streptococcus equi surbsp. equi. та Streptococcus equi surbsp. zooepidеmiсus.

Дикі типи стрептококів синтезують позаклітинні білки, що знижує вихід біополімеру. Тому для отримання відтворювальних гіалуронідазанегативних, не гемолітичних штамів, проводили їх модифікацію за допомогою хімічного та УФ-індукованого мутагенезу або ненаправленого мутагенезу з подальшою селекцією. Генно-інженерні штами кишкових паличок, отримані на основі методів експресії оперонів, що кодують синтез гіалуронатсинтетази стрептококів на матрицю бактерій, в даний час не застосовуються через низькі показники виходу біополімеру. Винятком можна вважати генно-інженерний штам Bacillus subtilis, що показує високі результати виходу біополімеру при зростанні на складних ферментованих середовищах.

Біотехнологія мікробного синтезу гіалуронової кислоти на основі штамів Streptococcus zooepidemicus. Типовий склад синтетичного живильного середовища для бактерій роду Streptococcus, що синтезують гіалуронова кислоту, наведено нижче.

Джерело вуглеводу та енергії: глюкоза – 1000; амінокислоти: DL-аланін, L-аргінін, L-аспарагінова кислота, L-цистин, L-цистеїн, L-глутамінова кислота, L-глутамін, L-гліцин, L-гістидин, L-ізолейцин, L-лейцин, L- лізин, L-метіонін, L-фенілаланін, гідрокси-L-пролін, L-серин, L-треонін, L-триптофан, L-тирозин, L-валін по 100; вітаміни: біотин - 0,2; фолієва кислота - 0,8; нуклеотиди: аденін - 20, гуанін гідрохлорид - 20, урацил - 20; солі органічних та неорганічних кислот: FeS04*7H20 - 5, Fe(N03)2*9H20 - 1, К2НР04 - 200, КН2Р04 - 1000, MgS04*7H20 - 700, MnS04 - 5, СаС12*3H20 4500, NaHC03 - 2500, NaH2P04 * H20 - 3195, Na2HP04 - 7350.

Культивування бактерій роду Streptococcus з метою отримання ГК здійснюється, як правило, у періодичних умовах. Поживне середовище готують одноразово, розчиняючи необхідні компоненти середовища у воді, після чого стерилізують середовище. Джерело вуглецю стерилізується окремо. Після засіву за ходом ферментації стежать за споживанням субстрату, зростанням концентрації клітин, утворенням продукту (ГК), продуктів метаболізму, зміною рН середовища. Максимальна концентрація ЦК становить приблизно 5 г/л. Подальше зростання вмісту в середовищі ГК веде до багаторазового зростання в'язкості КЖ, різкого погіршення масообмінних характеристик процесу ферментації, труднощів при аеруванні та перемішуванні. Концентрація ГК при періодичній або періодичній з підживленням субстрату ферментації досягає заданого значення за 6 - 26 години. Як правило, після виходу культури у стаціонарну фазу процес завершують. Клітини мікроорганізмів інактивують прогріванням при 60-80 °С. Біомасу відокремлюють одним із добре відомих способів - флокуляцією, сепаруванням, центрифугуванням, фільтруванням. ГК з КЗ осаджують органічними розчинниками або катіонними ПАР. Очищення проводять за допомогою ультрафільтраційних методів, переосадження або хроматографії.

Дані методи принципово не відрізняються від методів виділення ЦК із тваринної сировини, описаних раніше. Наприклад, у патенті на метод отримання ГК описаний наступний спосіб культивування штаму-продуцента та виділення ГК. Ферментацію здійснювали у біореакторі на 3 л (коефіцієнт заповнення ферментера 0,5) на середовищі складу: 2,0 % глюкози, 0,5 % ДЕ, 1,5 % пептону, 0,3 % КН2Р04, 0,2 % К2НР04, 0,011 % Na2S203, 0,01 % MgS04 * 7Н20, 0,002 % Na2S03, 0,001 % СоС12, 0,001 % MnCl2 та 0,5 % соєвої олії; рН середовища 7,0. Стерилізація середовища здійснювалася глухою парою 120 ° С протягом 15 хв. Після охолодження до кімнатної температури вносився інокулят культури S. zooepidemicus штам Ferm ВР-878 у кількості 0,1 л. Аеробне культивування (витрата повітря 0,7 л/(л*хв) тривало 26 годин при постійному термостатуванні (35 °С) та перемішуванні середовища (300 об/хв). рН середовища підтримувався постійним на рівні 7,0. години культивування в асептичних умовах вносилося підживлення по субстрату - 100 мл 50% розчину глюкози.Процес завершували після 26 годин культивування.

Для виділення ЦК проводили такі процедури. До бактеріальної культури додавали 3,2 л дистильованої води. Після ретельного та тривалого перемішування біомасу відділяли центрифугуванням. Супернатант концентрували до 1,6 л на ультрафільтраційному половолоконному апараті та проводили діаліз проти дистильованої води. У розчин, що утворився, вносили ацетат натрію до кінцевої концентрації 0,5 % і проводили осадження 5 л етилового спирту. Осад полісахаридів відокремлювали центрифугуванням. Очищення ЦК проводили, розчиняючи отриманий осад у дистильованій воді (0,5 л) і додаючи 4% водний розчин цетилпіридину броміду. Осад пов'язаної з катіонним ПАР ДК відокремлювали і розчиняли в 40 мл 0,3 М розчину хлориду натрію. Нерозчинену частину осаду відбраковували. До розчину додавали 120 мл етанолу для осадження ЦК. Осад відокремлювали та розчиняли в дистильованій воді, після чого проводили очищення на іонообмінній смолі та повторне спиртоосадження. Вихід очищеного гіалуронату натрію з однієї ферментації становив 7,8 г. Вміст білка в препараті становив менше 0,05%. Молекулярна маса ДК дорівнювала 1,005 МДа.

Інші способи біотехнологічного отримання ГК, описані у патентах, незначно відрізняються складом середовищ.

Біотехнологія мікробного синтезу гіалуронової кислоти з урахуванням штамів бактерій Bacillus subtilis. До способів отримання гіалуронової кислоти, відноситься метод біосинтезу ГК на основі генно-модифікованого штаму Bacillus subtilis, що містить генетичну конструкцію, що включає промотор, функціонально активний у зазначеній клітині, і кодуючу область, що складається з нуклеотидної послідовності, що кодує стрептококs; послідовності, що кодує UDP-глюкозо-6-дегідрогеназу Bacillus (tuaD) або аналогічний фермент стрептококового походження (hasB), і послідовність, що кодує бактеріальну або стрептококову UDP-глюкозопірофосфорилазу.

Метод включає культивування клітини-господаря Bacillus в умовах, придатних для продукування гіалуронової кислоти, при цьому клітина-господар Bacillus містить конструкцію нуклеїнової кислоти, що включає послідовність, що кодує гіалуронансинтазу, функціонально пов'язану з промоторною послідовністю, чужорідною щодо послідовності; та вилучення гіалуронової кислоти з середовища культивування.

6. Застосування гіалуронової кислоти

Гіалуронова кислота - речовина з величезним спектром дії, і справді дивовижними властивостями. Через кілька років після відкриття гіалуронової кислоти починається розробка препаратів на основі глюкозоамінолікану для зовнішнього застосування як засіб, що підвищує регенеративні та бар'єрні функції шкіри. Однак, як відомо, субстанція, виготовлена ​​з тваринної сировини, вимагає ретельного очищення від домішок, що накладає додаткові витрати виробництва та відбивається на ціні кінцевого продукту. Дійсно висока собівартість гіалуронової кислоти довгий час перешкоджала розширенню спектра застосування біополімеру, проте поступове збільшення знань про властивості полімеру і впровадження біотехнологічних методів на основі мікробного синтезу, дозволило істотно знизити собівартість субстанції, підштовхує розвиток різноманітних додатків, в яких знаходить застосування. харчової, фармацевтичної, космецевтичної промисловості Ведуться дослідження зі створення лікарських препаратів та БАД на основі гіалуронату з протизапальною, імуномодулюючою та пролонгуючою дією, які, можливо, у майбутньому можна буде застосовувати як основу терапії захворювань в онкології, оториноларингології, хірургії, ендокринології та багатьох інших сфер.

6.1. Гіалуронова кислота в медицині

Гіалуронова кислота має антимікробну та регенеруючу дію, тому на основі її розроблені препарати для ефективної терапії уражень шкіри. Створені спочатку як препарати проти опіків, група активно застосовується при терапії трофічних порушень шкірного епітелію посттромботичного генезу. Доведено, що низькомолекулярна гіалуронова кислота (менше 10 кДа) має ангіогенну дію, тим самим знижуючи утворення спайок та розростання сполучної тканини, так само покращує мікроциркуляцію та знижує ефекти запалення.

Гіалуронат має властивості підвищувати активність інтерферону, тим самим виявляючи виражену противірусну дію. Було доведено високу активність препаратів на основі гіалуронової кислоти щодо вірусу герпесу та деяких інших. За даними деяких джерел високомолекулярна гіалуронова кислота є пролонгатором дії інших БАВ, розчинених у ній. Лікарські речовини, за рахунок високої в'язкості гіалуронату, виділяються у тканині протягом тривалого часу. Створюється так зване депо, з якого БАВ поступово дифундує у середовище організму. Це дозволяє збільшити терапевтичну широту, потенціювати в деяких випадках фармакологічний ефект, знизити побічні ефекти, а також розширити можливості застосування інших лікарських речовин (стероїдних препаратів, антибіотиків, пептидів, НПЗЗ тощо) у комбінації з гіалуроновою кислотою. Широко застосування гіалуронату у хірургії:

1. Офтальмологічна хірургія – гіалуронат натрію використовується як репаративний засіб при оперативних втручаннях на ендотеліальному шарі рогівки (видалення катаракти).

2. Хірургічна травматологія - при хірургічних операціях з великим перерізом хрящової тканини та ускладнених артритах використовується як регенеруючий, змащувальний, протизапальний та аналгезуючий засіб.

6.2. Гіалуронова кислота у косметології

Застосування гіалуронату та його солей у косметології ґрунтується на здатності гіалуронатвмісних препаратів надавати місцеву протизапальну, ранозагоювальну та імуномодулюючу дію. Здатність затримувати у міжклітинному просторі воду є основою механізму корекції вікових деформацій шкіри. На даний момент у косметологічній практиці стали дуже популярними ін'єкції 1-3% водного розчину гіалуронової кислоти для внутрішньо- або підшкірного введення. Введення гіалуронової кислоти в епітелій у вигляді водного гелю підвищує еластичність та пружність тканин, тим самим надаючи шкірі колишні якості та красу. Однак найширше застосування високомолекулярний гіалуронат отримав при виготовленні різних комбінованих кремів та гелів для зовнішнього застосування. Цей вид продукції має таку ж спрямованість, як і ін'єкції - відновити реологічні властивості шкіри, цим запобігти утворенню зморшок, прищів тощо. .

Гіалуронова кислота має властивості, які роблять її вкрай придатною для використання як дермальний філлер: вона здатна зв'язувати велику кількість води, присутня в шкірі в природних умовах і не схильна викликати небажані реакції. Філери (Fill - від англ. - Наповнювати) - це ін'єкційні шкірні наповнювачі, які використовуються в косметології для зменшення глибини зморшок, носогубних складок та складок у куточках рота. Філери також використовуються для надання додаткового об'єму особі в області вилиць, щік і губ В даний час широкого поширення набула група ГК-філерів сімейства Surgiderm і Juvederm Ultra А. Surgiderm і Juvederm Ultra є однорідними монофазними гелі гіалуронової кислоти нетваринного походження. Вони є одними з найбільш пластичних матеріалів для ін'єкційної контурної пластики, що визначає не тільки легкість їх введення, але й рівномірний розподіл тканин, дозволяє повністю виключити контурування матеріалу.

Сучасна серія препаратів з урахуванням гіалуронової кислоти PRINCESS®. «PRINCESS® Filler» є стерильний, біодеградований, в'язкоеластичний, прозорий, безбарвний, ізотонічний та гомогенізований гелевий імплантат для інтрадермальних ін'єкцій. Гіалуронова кислота, що міститься в «PRINCESS® Filler», з поперечно-зшитою структурою продукується бактеріями Streptococcus equi, представлена ​​у вигляді розчину з концентрацією 23 мг/мл у фізіологічному буфері.

Висновок

Гіалуронова кислота - продукт тваринного походження, що має воістину дивовижні якості і високий діапазон застосування як сьогодні, так і в перспективі подальшого її використання. Тому зовсім не дивно, що її властивості вивчаються у всьому світі.

В даний час досліджуються процеси та механізми дії гіалуронової кислоти на тканини організму. Висуваються гіпотези щодо ролі гіалуронату та споріднених глюкозоаміногліканів у процесах проліферації, диференціації, міграції тварин клітин у процесах імунної відповіді та ембріогенезу, а також робляться спроби встановлення зв'язку між молекулярною масою, ступенем очищення та ефективністю препаратів.

Фізико-хімічний спосіб, через свою економічну нерентабельність, поступово поступається місцем біотехнологічному методу синтезу біополімеру. Були проведені пошуки продуцентів, що відповідають усім параметрам, а також різноманітних випробувань щодо вивчення метаболізму гіалуронових кислот. Результатом дослідження служило виявлення прямого зв'язку між здатністю синтезу гіалуронових кислот та наявністю специфічних ферментів гіалуронатсинтетаз.

В останні 20 років оперон, що кодує синтез гіалуронатсинтетаз, був виділений у чистому вигляді та неодноразово експресувався різним видам мікроорганізмів з метою отримання генно-модифікованих штамів-продуцентів гіалуронових кислот. Однак результату не могли досягти дуже довгого часу. Генно-модифіковані штами виробляли неактивну форму ферменту, отже, здатність до продукції гіалуронових кислот не володіли. Але нещодавно проведені дослідження щодо створення генно-модифікованого штаму на основі бактерій Bacillus sibtilis показали добрі результати. Штами бактерій активно синтезували гіалуронат високої молекулярної маси, позбавленої пептидних включень та зв'язків із спорідненими мукополісахаридами.

Однак пошук штамів-продуцентів зараз продовжується. Перевіряються можливості синтезу гіалуронату бактеріями роду Streptomyces, та ведеться розробка біотехнології на їх основі; крім того, вивчаються шляхи використання та впровадження гіалуронату у всі сфери життєдіяльності суспільства.

Бібліографічне посилання

Савоськін О. В., Семенова Є. Ф., Рашевська Є. Ю., Полякова А. А., Грибкова Є. А., Агабалаєва К. О., Мойсеєва І. Я. ХАРАКТЕРИСТИКА РІЗНИХ МЕТОДІВ ОТРИМАННЯ ГІАЛУРОНОВОЇ КИСЛОТИ огляд. Біологічні науки - 2017. - № 2. - С. 125-135;
URL: https://science-biology.ru/ru/article/view?id=1060 (дата звернення: 13.12.2019). Пропонуємо до вашої уваги журнали, що видаються у видавництві «Академія Природознавства»

Гіалуронова кислота була відкрита у 1934 році, перші ж детальні її дослідження почали проводитись у 1949 – 1950 роках. Ця речовина була виділена з різних тканин тварин - суглобової рідини, пуповини та тканин півнячого гребеня. Крім того, в 1937 році гіалуронову кислоту вдалося отримати з капсул стрептококів. Перші дослідження фізичних та хімічних властивостей гіалуронової кислоти проводились методом рентгенівської кристалографії.

Проблеми отримання ЦК

Основною проблемою для дослідження гіалуронової кислоти, з якою зіткнулися вчені, була складність її виділення у чистому вигляді, очищеної від білків та інших компонентів. Труднощі виникали тому, що завжди мав місце ризик руйнування полімерної структури гіалуронової кислоти в процесі очищення. При цьому вчені випробували різноманітні методи фізичного, хімічного та ферментативного очищення.

Трохи пізніше почалися дослідження можливості біосинтезу гіалуронової кислоти. 1955 року такий спосіб уперше було знайдено. Група вчених виділила молекули гіалуронової кислоти з екстракту стрептококів. Завдяки цьому відкриттю стало можливим синтезувати гіалуронову кислоту - використовуючи ферментативну фракцію, взяту зі стрептококів.

Гіалуронова кислота - Застосування

Головний прорив у застосуванні гіалуронової кислоти стався у 50-ті роки. Завдяки відкриттю цієї речовини для використання в медицині, було розпочато його промислове виробництво та популяризація як лікарський засіб.

У 1970 році гіалуронова кислота була затверджена, як доведено ефективний засіб від артритів – після отримання позитивних результатів тестування на тваринах. В результаті проведеного досвіду було виявлено виражений клінічний ефект із зменшенням симптомів.

Кількома роками пізніше гіалуронову кислоту почали використовувати у складі імплантованих внутрішньоочних лінз, що швидко зробило її одним з компонентів, що найчастіше використовуються в хірургічній офтальмології. З цього моменту стали пропонуватися і випробовуватися різні способи та сфери застосування гіалуронової кислоти.

ЦК на сьогоднішній день

У 90-ті роки гіалуронова кислота знайшла широке застосування в естетичній медицині та косметології, завдяки своїм унікальним вологоутримуючим, а також антисептичним та антиоксидантним властивостям. На даний час вона використовується в різних косметологічних цілях, а дослідження її властивостей та можливих областей застосування продовжуються.

Жити довго та щасливо, не старіти та не вмирати – мрія кожної людини. Світ не стоїть на місці, і людство вже на межі відкриття. Все це стане можливим завдяки гіалуронової кислоти та її застосування в медицині та косметології.

Будь-яка жінка хоча б раз у житті стикалася з терміном «гіалуронова кислота». Проте не кожна розуміє, чому саме гіалуронова кислота так цінується у світі косметології. За що її визнають усі косметологи та лікарі?

Що таке гіалуронова кислота?

Гіалуронова кислота є полісахаридом із сімейства глюкозаміногліканів, яка є одним з компонентів тканин та рідин людини. Ця кислота міститься як у клітинах людини, так і у клітинах тварин і навіть бактерій. Ще з часів шкільних уроків з біології ми знаємо, що тіло людини складається з клітин, ті у свою чергу утворюють органи, а от порожнє місце між органами та клітинами наповнене сполучною тканиною.

Гіалуронова кислота входить до складу сполучної тканини та є головним елементом міжклітинного матриксу. Сполучна тканина може бути в рідкому та твердому стані, а також у вигляді гелю. У рідкому стані гіалуронова кислота присутня у слині, у спинномозковій рідині, а також у синовіальній (рідина, що заповнює порожнину суглобів).

У твердому стані гіалуронат входить до складу кісток, а у вигляді гелю вона присутня у склоподібному тілі, хрящах та міжклітинній рідині. У великому обсязі гіалуронову кислоту синтезують у шкірі специфічні клітини – фібробласти. Фібробласти – це клітини сполучної тканини, основна функція яких полягає у синтезі, крім гіалуронової кислоти, колагену та еластину.

Основна кількість усієї гіалуронової кислоти зосереджена у шкірі, розташовується вона у сполучній тканині дерми між волокнами колагену та еластину, а також у клітинах рогового шару корнеоцитів. Якщо провести якусь аналогію і представити нашу шкіру у вигляді матраца, то можна сказати, що колаген та еластин – це пружини, а гіалуронова кислота – це поролон, що заповнює простір між ними.

Як ми встигли помітити з вищесказаного, гіалуронова кислота є природною складовою нашого організму. Вона синтезується в ньому і бере участь у багатьох біологічних процесах. Її роль організмі воістину неоціненна.

Роль гіалуронової кислоти в організмі

Гіалуронова кислота має чудові властивості. Найважливіша і найцінніша якість – це здатність зв'язувати та утримувати воду. Відомо, що одна молекула гіалуронової кислоти пов'язує 500 молекул води. Також вона має так званий «ефект памперсу» - здатність не віддавати вологу зі шкіри.

Як важливий компонент позаклітинного матриксу, гіалуронат забезпечує життєдіяльність клітин, заповнюючи простір між ними. Гіалуронова кислота бере участь у процесі проліферації (розростання тканини шляхом поділу клітин), забезпечує транспортування кисню, лімфоцитів та інших молекул крові та поживних речовин до місця ушкодження тканин та вогнищ запалення.

Але мало хто знає, що, крім своїх чудодійних якостей, гіалуронат відіграє важливу роль у процесі міграції злоякісних пухлин та дифузії стрептококової інфекції. Тому надлишок гіалуронової кислоти також небезпечний, як і її недолік: все залежить від процесів, що відбуваються в організмі.

Виробництво гіалуронової кислоти в організмі може прискорюватися або сповільнюватися, її кількість може збільшуватися або зменшуватися, і це не пов'язане з віком. Косметологи звикли вважати, що дефіцит гіалуронової кислоти в організмі є деяким показником старіння шкіри, який дозволяє призначати препарати на її основі як лікування та профілактику вікових змін шкіри. Але це не так.

Найважливішими причинами, які сприяють синтезу гіалуронату, є запалення, пошкодження тканин або травма. У місцях ушкодження тканин, запалення чи травми значно збільшується кількість гіалуронової кислоти.

Види гіалуронової кислоти

Залежно від кількості фрагментів, що становлять молекулу гіалуронової кислоти, вона може мати різну масу та довжину.

Низькомолекулярна гіалуронова кислота має виражену протизапальну дію. Використовується для лікування трофічних виразок, опіків, псоріазу та інших шкірних захворювань. Цей вид гіалуронату входить до складу засобів для зовнішнього застосування: кремів, тоніків, емульсій та сироваток. Вони здатні, не втрачаючи своїх властивостей, глибоко проникати в шкіру.

Важливий момент, який слід враховувати при використанні препаратів на основі гіалуронової кислоти, – це вологість повітря.

Коли вологість повітря низька, гіалуронова кислота дає зворотний зволоженню ефект. Верхні шари шкіри стягуються, стають сухими, створюється ефект маски на обличчі. Щоб усунути ці неприємні відчуття, потрібно відразу ж після гіалуронової кислоти нанести на обличчя зволожуючу сироватку або живильний крем. Поживний та зволожуючий крем створить відчуття комфорту та зніме неприємні симптоми. Низькомолекулярні форми гіалуронової кислоти здатні підвищити пружність шкіри і частково заповнити зморшки, що вже сформувалися.

Середньомолекулярна гіалуронова кислота в ін'єкціях з масою від 100 до 500 кДа, запускає синтез ендогенної (власної) гіалуронової кислоти та процес неоколагеногенезу за рахунок стимуляції фібробластів. Також вона активно вживається в медичних цілях, зокрема для лікування деяких форм артриту та в офтальмології для лікування очей.

Високомолекулярна форма гіалуронату успішно застосовується у косметології для посиленої гідратації шкіри та заповнення втрачених обсягів. Завдяки своїм властивостям вона здатна утримувати велику кількість молекул води. Високомолекулярна гіалуронова кислота від 900 кДа і вище має великі реструктуруючі та антиоксидантні здібності. Крім того, її депонування в тканинах становить два тижні, порівняно з низькомолекулярною гіалуроновою кислотою, яка зберігається в тканинах один тиждень. Чим вище молекулярна маса гіалуронату, тим краще морфогенез полімерної мережі, тим більш в'язким стає розчин при низьких концентраціях. Це дозволяє покрити велику площу шкіри суцільною зволожувальною плівкою.

Ми її втрачаємо. Причини?

Згодом процес розпаду гіалуронової кислоти в організмі переважає її синтезом. Чому це відбувається? Як це не дивно, але всупереч домінуючому переконанню, зовсім не вік відіграє панівну роль у цьому процесі. Головна причина – це пошкодження шкіри ультрафіолетовим опроміненням типу А та В. Під згубною дією УФ-випромінювання відбувається пошкодження клітин шкіри та зменшення синтезу гіалуронової кислоти.

Одночасно зі зменшенням гіалуронової кислоти в організмі посилюються процеси її розпаду, при цьому продукти розпаду накопичуються і виводяться зі шкіри дуже повільно. Насправді, цей процес є захисною реакцією організму, оскільки УФ-випромінювання є головною причиною канцерогенезу, а гіалуронат бере участь у міграції та відсіюванні пухлинних клітин.

Другий важливий фактор, що сприяє деградації гіалуронової кислоти – фермент гіалуронідазу. Гіалуронідаза розщеплює гіалуронову кислоту, і цей процес відбувається безперервно. Основна частина гіалуронату розпадається та відновлюється знову протягом доби. Повне оновлення всього обсягу гіалуронової кислоти відбувається протягом 3-4 днів. І це передбачає розпад та новий синтез гіалуронату у всіх тканинах організму. Причиною розпаду може бути:

• вік;
• ультрафіолетове випромінювання;
• незбалансоване харчування;
• шкідливі звички (нікотин, алкоголь);
• психоемоційний стан;
• прийом певних лікарських засобів.

Ці причини впливають не лише на кількість синтезованої гіалуронової кислоти, а й на її структуру. Зниження кількості гіалуронової кислоти сприяє зменшенню води у складі деяких клітинних структур та появі перших ознак старіння.

До того ж природні вікові процеси можуть призвести до збільшення обсягу гіалуронової кислоти в дермі, що може стати причиною міжклітинного набряку, з одного боку, та зневоднення поверхневих шарів шкіри, з іншого боку.

Всі ці процеси впливають негативно на стан шкіри. Вона стає сухою, в'ялою, втрачає еластичність та пружність, на ній утворюються численні зморшки. І як результат: відображення у дзеркалі зовсім не тішить і стає джерелом прикрості.

Гіалуронова кислота у косметології

У косметології використовуються два промислові види гіалуронової кислоти:

• тваринного походження;
• з урахуванням біотехнологічного синтезу.

Довгий час у косметології застосовували гіалуронову кислоту тваринного походження. Її отримували шляхом подрібнення органів тварин (гребенів зрілих півнів, пупкових канатиків) внаслідок двофазного відчищення. У такому препараті зберігалися білки та пептиди тварини, що сприяло розвитку алергічних реакцій та відторгнення препарату.

Організм позиціонував цю форму гіалуронату як чужорідну речовину та запускав реакцію щодо усунення чужинця. Усе це, звісно, ​​впливало естетичний результат процедури. І замість довгоочікуваного омолодження, додавалися зайві клопоти з усунення ускладнень. У наші дні гіалуронова кислота тваринного походження майже не використовується.

Але наука не стоїть дома. Створюються нові технології та препарати, здатні повністю мінімізувати побічні ефекти, ускладнення та ризики. Тому зараз у косметології використовують гіалуронову кислоту, одержану шляхом біохімічного синтезу.

Для цих цілей застосовують бактеріальні культури, саме стрептококи, вирощені на рослинній основі (пшеничному бульйоні). Цей метод базується на можливості деяких мікроорганізмів синтезувати гіалуронову кислоту. Біохімічний метод дозволяє досягти великої кількості речовини з необхідною молекулярною вагою та з прийнятною структурою.

Безпосередньо у філерах використовується:

• стабілізована (нативна, натуральна);
• нестабілізована (хімічно модифікована).

Дія гіалуронової кислоти залежить від її виду. Кожен вид має свої переваги і свої ефекти. Велике значення має рівень очищення препарату. Деякі препарати на основі гіалуронату містять додаткові речовини у вигляді вітамінів, амінокислот, біологічно активних речовин. Інші ж є «чистими», у яких міститься лише гіалуронова кислота, яка діє як самостійний компонент. Найефективнішою вважається стабілізована гіалуронова кислота.

Препарати на основі стабілізованої гіалуронової кислоти довго зберігаються у шкірі, складають основу препаратів гідрорезерву та запускають регенеративні процеси у дермі.

Молекула гіалуронової кислоти дуже чутлива. Вона гостро реагує на хімічну модифікацію: термічну чи механічну. Тому слід правильно зберігати її в процесі хімічних реакцій. Стабілізована гіалуронова кислота виходить методом біохімічного синтезу, потім слідує процес зшивання, який називається стабілізацією (формування сшивок, що перетинаються між молекулами гіалуронової кислоти).

Молекули гіалуронової кислоти піддаються зшиванню з метою запобігання їх швидкій деградації. Така гіалуронова кислота демонструє довгі клінічні ефекти при її введенні у шкіру. Після зшивання отримані гелі проходять очищення, яке є дуже кропітким процесом і є вирішальним фактором при ціноутворенні препаратів гіалуронової кислоти, що стабілізує.

Залежно від рівня стабілізації виробляються гелі різної в'язкості для усунення різноманітних естетичних проблем: мало стабілізовані для усунення дрібних зморшок, більш стабілізовані і більш в'язкі для корекції носогубних складок і відновлення втрачених обсягів.

Стабілізована гіалуронова кислота використовується в контурній практиці та при армуванні особи, оскільки цей вид гіалуронату добре тримає об'єм. Тобто коли треба заповнити втрачені обсяги, наприклад, щік, виштовхнути носогубні складки ззовні, змоделювати контур обличчя та заповнити провали на обличчі, використовується стабілізована гіалуронова кислота.

Нестабілізована гіалуронова кислота використовується в мезотерапії та біоревіталізації для гідратації тканин та поліпшення еластичності шкіри.

Ін'єкційні методи на основі гіалуронової кислоти

Ін'єкційні методи та техніки на основі препаратів з гіалуроновою кислотою дають фантастичні результати. Але не всяка гіалуронова кислота сприяє покращенню шкірних характеристик. Для того щоб запускалися механізми регенерації в дермі, необхідно дотримання декількох умов:

1. Гіалуронат має бути стабілізованим (натуральним, нативним).
2. Молекулярна маса гіалуронату має перевищувати 1 млн. Дальтон.
3. Концентрація гіалуронової кислоти у препараті має перевищувати 15 мг на мілілітр.
4. Гіалуронова кислота має бути в'язкою консистенції.

Якщо ці умови не дотримуються, то фібробласти не активізуються і процес омолодження не запускається.

Препарати на основі гіалуронової кислоти використовуються у таких ін'єкційних методиках:

• біоревіталізація;
• мезотерапія;
• біорепарація;
• редермалізація;
• контурна пластика;
• біоармування.

Біоревіталізація- Найпопулярніша і найефективніша процедура в косметології. Вона ґрунтується на введенні гіалуронової кислоти у середні шари шкіри. Використовується у всіх випадках вікового в'янення шкіри, при лікуванні акне та післяпологових розтяжок.

Мезотерапія– введення гіалуронової кислоти та коктейлів на її основі методом множинних ін'єкцій.

Біорепарація– введення гіалуронової кислоти з вітамінами, амінокислотами та пептидами.

Редермалізація– введення ін'єкцій гіалуронової кислоти та сукцинату натрію (похідне бурштинової кислоти).

Контурна пластика- Поповнення втрачених обсягів за допомогою гіалуронового гелю.

Біоармування особи– відновлення контурного контуру овалу обличчя гіалуроновим біогелем.

Протипоказання до застосування гіалуронової кислоти

Незважаючи на те, що гіалуронова кислота синтезується нашим організмом, а модифіковані препарати на її основі мають високий ступінь відчистки, все ж таки трапляються випадки відторгнення препарату і виникнення алергічних реакцій. Це пов'язано з тим, що неможливо повністю очистити отриманий препарат від вмісту чужорідних білкових домішок. Саме ці домішки викликають небажані побічні дії та ускладнення. Також додаткове впровадження гіалуронової кислоти в організм може викликати непередбачені наслідки, оскільки вона відіграє велику роль у міграції злоякісних пухлин та поширенні різних інфекцій. Існує низка серйозних протипоказань, які необхідно враховувати.

Не слід використовувати препарати на основі гіалуронової кислоти у випадках:

• аутоімунних та онкологічних захворювань;
• інфекційних та хронічних захворювань у стадії загострення;
• вагітності та лактації;
• запалення шкіри на обличчі;
• індивідуальної непереносимості препарату.

Недотримання цих застережень може призвести до тяжких наслідків.

Гіалуронова кислота - правда і вигадка

Будь-яка чудодійна речовина викликає масу суперечок і толків, у яких дуже мало правди, але багато вигадки. Зайво вразливі натури приписують гіалуронової кислоти то чарівні та магічні властивості, то скрізь шукають каверзу та приховані змови. Розглянемо деякі усталені міфи.

Міф перший: ін'єкції з гіалуроновою кислотою викликають звикання.

Це не вірно. «Підсісти на голку» можна лише з психологічної точки зору. Коли пацієнт вживає ефективні косметичні препарати, він помічає, як покращується його зовнішній вигляд. Цей стан йому подобається, піднімається його самооцінка, він починає звикати до нього. Зростає бажання виглядати все краще та краще. Але це ніяк не пов'язане з гіалуроновою кислотою. Гіалуронова кислота у кремах діє лише на поверхневий шар епідермісу. В ін'єкціях гіалуронова кислота стимулює власні клітини, повертаючи їх до природних процесів, які вони встигли призабути в міру дорослішання шкіри. А після закінчення терміну дії гіалуронова кислота розпадається в організмі та повністю зникає. Вона не може викликати залежність.

Міф другий: велика молекулярна маса гіалуронової кислоти не дозволяє їй проникати у шкіру.

Частково правильно. Якщо йдеться про косметичні препарати у вигляді кремів, емульсій, сироваток, то так і є. Ці препарати покликані працювати у верхніх шарах епідермісу. Вони не є ліками і не повинні проникати крізь бар'єр шкіри. Але річ у тому, що вчені давно навчилися дробити молекулу гіалуронової кислоти та створювати її низькомолекулярні форми. Низькомолекулярна гіалуронова кислота, що міститься в кремі, цілком здатна проникати у шкіру.

Міф третій: гіалуронова кислота в ін'єкціях сприяє підвищенню внутрішньоочного тиску.

Гіалуронова кислота входить до складу багатьох біологічних рідин, вона є компонентом нашого організму, присутня у багатьох органах, зокрема входить до складу склоподібного тіла. Вперше історія гіалуронова кислота почала вживатися в офтальмології. Тому вона ніяк не може підвищувати внутрішньоочний тиск.

Міф четвертий: уколи краси з ботуліном і гіалуроновою кислотою – це те саме.

Дуже безграмотне твердження. Ботулін - це нейротоксин, продукт життєдіяльності бактерій Clostridium botulinum. Препарати на основі ботуліна паралізують м'яз, не дозволяючи йому скорочуватися. Він не впливає на шкірні механізми, не запускає процес регенерації клітин, а лише на якийсь час розслаблює м'яз і тим самим сприяє усуненню зморшок. Гіалуронова кислота входить до складу нашого організму, вона запускає процеси регенерації та активізації клітин дерми, зволожує шкіру, заповнює втрачені обсяги. Це дві абсолютно різні речовини, у них різні функції та ролі.

Дуже поширена помилка. Захищати шкіру треба в будь-яку пору року, особливо взимку, коли сухе кондиціоноване повітря та гаряче повітря від батарей у приміщеннях сприяють сухості та зневодненню шкіри. Просто треба знати, що наноситься зволожуючий крем за півгодини до виходу на мороз. У цей період року необхідно посилено як живити, так і зволожувати шкіру.

Міф шостий: ін'єкції з гіалуроновою кислотою витягають вологу з глибоких шарів шкіри.

Зрозуміло, це негаразд. Все відбувається з точністю навпаки. Гіалуронова кислота зволожує, насичує шкіру вологою. У нашому організмі розпад та синтез гіалуронової кислоти відбувається щодня. І кожні три-чотири дні повністю заповнюється кількість гіалуронової кислоти у всіх системах та органах. Ін'єкції або креми не здатні «витягувати» воду з глибоких шарів шкіри ще й тому, що гіалуронова кислота має «ефект памперсу» і не віддає вологу зі шкіри.

У сучасній косметології виникла потужна зброя – гіалуронова кислота. Вона стала предметом серйозних наукових досліджень та стала активно використовуватися в естетичній медицині. За останні кілька років гіалуронова кислота довела свою ефективність, визнану у всьому світі. На її основі побудована ціла індустрія омолоджувальних технологій та препаратів. Але для того, щоб не потрапити в пастку до власних уподобань, треба ознайомитися з її лікувальними ефектами, способами виробництва та видами. Адже навіть чудодійний препарат може принести як користь, так і шкоду.

Будьте цікавими разом із !

У цьому історичному огляді, присвяченому гіалуронової кислоти, ми постаралися привернути увагу відвідувача вебсайту до найважливіших відкриттів та досліджень, на яких будувалися всі подальші роботи в галузі вивчення цього унікального полісахариду. Вибір даних та джерел для огляду є цілком суб'єктивним.

ВСТУП

Зараз жодних принципово нових даних про гіалуронову кислоту не існує, тому ми вирішили зробити темою цієї невеликої статті «Гіалуронова кислота – історія». При існуючому нині темпі руху наукової думки далеко ще не кожна людина має достатньо часу у тому, щоб озирнутися і переглянути дані літератури, у якій описані ключові відкриття області гіалуронової кислотиТому ми постаралися коротко викласти існуючі результати. Вибір джерел і даних ґрунтується лише на наших знаннях та думці, тому може розходитися з поглядами інших людей.

ЯК ВСЕ ПОЧИНАЛОСЯ

Угорський учений Bandi Balazs емігрував з Угорщини у 1947 році. Приїхавши до Швеції, він почала працювати у Стокгольмі над проблемою біологічної ролі позаклітинних полісахаридів, причому особливо багато уваги він приділяв саме гіалуронату.

У роки культуральна робота з клітинами виглядала зовсім інакше. До появи антибіотиків всі маніпуляції виконувались у строго стерильних умовах близьких до умов операційної. Клітини вирощували на підвішених згустках фібрину. Фібробласти виділялися із подрібнених курячих сердець, шматочки яких клалися на фібринові згустки, а швидкість зростання культури визначалася за зміною площі колонії, яка вказувала на швидкість та відстань міграції клітин.

Одним із перших відкриттів було виділення з тканини пуповини. гіалуронатудля того, щоб потім вводити його у культуру фібробластів.

Гіалуронатвиділявся з пуповинної крові та преципітувався у спирті. Потім його очищали від білків шляхом струшування екстракту суміші хлороформу і ізоамілового спирту (за методом Sewag). Була спроба розробити метод стерилізації в'язкого розчину гіалуронату. Його не можна було піддавати фільтрації, тому зрештою вчені дійшли використання автоклавування.

На початку роботи було зроблено три дуже важливі спостереження, які заклали основу для подальших досліджень.

По-перше, вдалося виділити гіалуронат з тканини пуповини, причому за різних іонних умов було отримано матеріал з різним ступенем в'язкості. Найвища в'язкість була у розчину, виготовленого на дистильованій воді. Вчені припустили, що в'язкість розчину гіалуронату може коливатися в залежності від значення рН та іонної сили розчинника. Зараз це вже знає кожен, проте на той момент цей феномен був описаний Raymond Fuoss лише для синтетичних розчинів поліелектролітів. У журналі "Journal of Polymer Chemistry" була опублікована стаття "The viscosity function of hyaluronic acid as a polyelectrolyte" (Показник в'язкості гіалуронової кислоти як поліелектроліту). З цього моменту вчені зайнялися дослідженнями фізичних і хімічних властивостей гіалуронату.

По-друге, при спробі простерилізувати гіалуронат за допомогою УФ-випромінювання він повністю втратив в'язкість у розчині. Надалі було показано, що при впливі потоку електронів гіалуронат також повністю деградується. Зараз уже можна сказати, що те спостереження було одним із перших описів вільнорадикального розщеплення гіалуронату.

По-третє, досліджувалися й біологічні ефекти гіалуронатуі ряду сульфатованих полісахаридів - гепарину, гепарансульфату (який у ті роки називався «гепарин-односерной кислотою») та синтетично сульфатованого гіалуронату. Вчені порівняли їх вплив на зростання культури клітин, антикоагулянтну активність та антигіалуронідазну активність. Головним завданням було з'ясувати, чи дійсно гепарин є сульфатованим гіалуронатом, як це стверджувалося в роботах Asboe-Hansen, однак було зроблено висновок, що це твердження було помилковим.

Гіалуронат, на відміну від сульфатованих полісахаридів, прискорював ріст клітин і це, мабуть, був одним із перших описів взаємодії гіалуронату з живими клітинами – сьогодні ми знаємо, що ця взаємодія опосередкована клітинним рецептором. Цікаво, що це було також одним із перших досліджень, присвячених вивченню біологічної активності гепарансульфату.

Всі вищесказані дослідження були виконані в короткий проміжок часу, починаючи з вересня 1949 року по грудень 1950 року, тобто зайняли лише трохи більше 1 року.

ВІДКРИТТЯ ГІАЛУРОНАТА І ГІАЛУРОНІДАЗИ

Karl Meyer відкрив гіалуронат 1934 року під час роботи в очній клініці в Університеті штату Колумбія. Він виділив це з'єднання зі склоподібного тіла ока корови в кислих умовах і назвав його гіалуроновою кислотою від грецького hyalos - склоподібної та уронової кислоти, яка входила до складу цього полімеру. Відразу слід сказати, що до цього були виділені й інші полісахариди (хондроїтинсульфат та гепарин). Більш того, ще в 1918 році Levene and Lopez-Suarez виділили зі склоподібного тіла та пуповинної крові полісахарид, що складався з глюкозаміну, глюкуронової кислоти та невеликої кількості сульфат-іонів. Тоді його назвали мукоітин-сірчаною кислотою, проте в даний час він більш відомий як гіаулуронат, який у їхній роботі був виділений з невеликою домішкою сульфату.

Протягом наступних десяти років Karl Meyer та ще цілий ряд авторів виділили гіалуронат із різних тканин. Так, наприклад, він був виявлений у суглобовій рідині, пуповині та тканині півнячого гребеня. Найцікавішим було те, що в 1937 році Kendall вдалося виділити гіалуронат із капсул стрептококів. Надалі практично з усіх тканин організму хребетних виділено гіалуронат.

Ще до відкриття гіалуронату Duran-Reynals виявив у насінниках якийсь біологічно активний фактор. Надалі його стали називати «поширюваний фактор». Схожу дію мали отрута бджіл і медичних п'явок. При його введенні підшкірно суміші з тушшю відзначалося дуже швидке поширення чорного фарбування. Цим фактором виявився фермент, що руйнує гіалуронати, який надалі назвали гіалуронідазою. Навіть у крові ссавців є певна кількість гіалуронідаз, але їх активація відбувається тільки при кислотних значеннях рН.

ВИДІЛЕННЯ ГІАЛУРОНАТУ

Найперший метод виділення гіалуронату був стандартним протоколом виділення полісахаридів, тобто за методом Sewag чи з допомогою протеаз з екстракту видалявся весь білок. Потім полімер преципітувався на фракції додаванням етилового спирту.

Великим кроком уперед став поділ різнозаряджених полісахаридів, який розробив John Scott при дослідженні методів преципітації з катіонним детергентом (ЦПХ, цетилпіридинхлоридом), у якому змінювалася концентрація солей. Гіалуронатз високою ефективністю відокремлювався від сульфатованих полісахаридів. Цим методом також можна було користуватися і для фракціонування молекулярною масою. За своєю суттю схожі результати можуть бути отримані при використанні методу іонно-обмінної хроматографії.

СТРУКТУРА ТА КОНФОРМАЦІЯ ГІАЛУРОНАТУ

Хімічна структура полісахаридної молекули була розшифрована Karl Meyer та його колегами у 1950-ті. Зараз всі знають, що гіалуронат є довгою полімерною молекулою, що складається з дисахаридних ланок, компонентами яких є N-ацетил-D-глюкозамін і D-глюкуронова кислота, пов'язані між собою В1-4 і В1-3 зв'язками. Karl Meyer не скористався стандартним методом для дослідження структури інтактного полісахариду. Натомість він проводив гіалуронідазнарозщеплення полісахариду, отримавши суміш дисахаридів та олігосахаридів, яку йому вдалося повністю охарактеризувати. На підставі отриманих ним результатів він зробив свій висновок про можливу структуру вихідної полімерної молекули.

Конформаційний аналіз «волокон», що складаються з гіалуронату, був вперше зроблений з використанням методу рентгенівської кірсталографії. На конференції у м. Турку 1972 року точилися гарячі суперечки між групами фахівців у тому, має гіалуронат спіральну структуру чи ні. Очевидно, що гіалуронат може формувати спіралі різної структури залежно від іонного складу розчинника та частки води у ньому. У 70-ті і 80-ті роки в літературі з'являлися різні версії структури гіалуронату.

Проривом у цій галузі стала робота John Scott. Спираючись на те, що гіалуронат має малу реакційну здатність при пероксидазному окисленні у водному розчині, він зробив висновок про те, що у воді він приймає конформацію з внутрішньоланцюжковими водневими зв'язками. Надалі його гіпотеза знайшла своє підтвердження при ЯМР-аналізі, а 1927 року Atkins із співавторами охарактеризували конформацію як подвійну спіральну.

ФІЗИЧНІ ТА ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ

П'ятдесят років тому не була відома хімічна структура гіалуронату та його макромолеуклярні властивості - маса, гомогенність, форма молекули, ступінь гідратованості та взаємодії з іншими молекулами. В останні 20 років це стало об'єктом уваги A. G. Ogston та його співробітників в Оксфорді, доктора Balazs з колегами в Бостоні, Torvard З Laurent, що працює у Стокгольмі, та ще кількох лабораторій.

Основною проблемою було виділення гіалуронату, очищеного від білків та інших компонентів, яке необхідно проводити перед будь-якими фізичними методами дослідження. Завжди є ризик деградації полімерної структури у процесі очищення. Ogston використовував техніку ультрафільтрації, припустивши, що вільні білки подолають фільтр, а білки, пов'язані з гіауронатом, буде затримано фільтром. Об'єктом дослідження став комплекс із вмістом білка рівним 30%. Інші автори намагалися використовувати різноманітні методи фізичного, хімічного та ферментативного очищення, які дозволяли знижувати вміст білка до кількох відсотків. У той же час, результати фізико-хімічного аналізу дали більш повний опис молекули. гіалуронату. Її молекулярна вага близька до кількох мільйонів, хоча розкид між зразками був досить високий. Розсіювання світла показало, що молекула поводиться як випадковим чином скручений, досить щільно упакований ланцюг з радіусом вигину близько 200 нм. Упакованість і малорухливість ланцюга пов'язана з наявністю внутрішньоланцюжкових водневих зв'язків, про які вже говорилося вище. Випадково скручена структура повністю відповідає отриманому співвідношенню в'язкості та молекулярної маси речовини. Ogston і Stanier використовували методи седиментації, дифузії, поділу в залежності від градієнта швидкості зсуву та в'язкості, а також метод подвійного заломлення, які показали, що молекула гіалуронату має форму високо гідратованої сфери, що цілком відповідає відомим властивостям молекул з упаковкою у вигляді випадково скрученої спіралі.

АНАЛІТИЧНІ МЕТОДИКИ

Єдино можливим шляхом кількісного дослідження гіалуронової кислоти було виділення полісахариду в чистому вигляді та вимірювання вмісту в ньому уронової кислоти та/або N-ацетилглюкозаміну. Методами вибору в даному випадку були карбазольні методи Діше для оцінки вмісту уронової кислоти та реакція Ельсона-Моргана на рівень гексозаміну.

У разі важко переоцінити важливість використання карбазольного методу. Під час аналізу гіалуронату іноді доводилося використовувати міліграми речовини.

Наступним кроком стало відкриття специфічних ферментів. Гіалуронідаза грибів Streptomycesдіяла лише на гіалуронат, утворювалися ненасичені гекса- і тетрасахариды. При аналізі змісту гіалуронатуможна було використовувати цю властивість грибів, особливо за наявності серед інших полісахаридів і домішок, а ненасичена форма гіалуронової кислоти може використовуватися зниження ліміту виявлення продукту. Ферментативний метод значно підвищив чутливість виявлення гіалуронату, довівши до рівня мікрограмів.

Останнім етапом стало використання афінних білків, що специфічно зв'язуються з гіалуронатом. Tengblad використовував гіалуронат-зв'язуючі білки з хрящів, а Delpech надалі використовував гіалуронектин, виділений з головного мозку. Ці білки можуть використовуватись при аналізі за аналогією з імунологічними методами, а після розробки цього методу точність кількісного визначення гіалуронатузросла до рівня нанограмів, що дозволило визначати зміст гіалуронатуу зразках тканин та фізіологічних рідинах. Метод Tengblad став основою більшої частини робіт Uppsala, виконаних пізніше.

ВІЗУАЛІЗАЦІЯ ГІАЛУРОНАТУ

Виявлення гіалуронату у зрізах тканин тісно пов'язане з аналізом полімерів у тканинній рідині. З самого початку використовувалися методи неспецифічного фарбування зі стандартними барвниками. John Scott вдалося підвищити специфічність за таким же принципом, яким він керувався при розробці методу фракціонування аніонних полісахаридів у детергентах. Він забарвлював їх барвником алціановий синій у різних іонних концентраціях, при цьому йому вдалося досягти помітного фарбування різних полісахаридів. Надалі він перейшов використання купромеронового синього.

У той же час гіалуронат можна добре виявляти на зрізах тканини за допомогою білків, що специфічно зв'язуються з ним. Перші повідомлення про такий метод були опубліковані в 1985 році. Цей метод використовувався з великим успіхом і завдяки йому були отримані цінні дані про розподіл вмісту гіалуронату в різних органах і тканинах.

Гіалуронаттакож може бути знайдений при електронній мікроскопії. На перших зображеннях, які були опубліковані Jerome Gross, на жаль, не вдалося побачити будь-яких тонких деталей структури. Першою роботою, що добре пояснювала результати, можна вважати статтю Fessler і Fessler. У ній було зазначено, що гіалуронат має протяжну одноланцюжкову структуру.

Потім Robert Fraser описав ще один витончений метод візуалізації навколоклітинно розташованого гіалуронату. Він додавав суспензію частинок гіалуронату до культури фібробластів. Частинки були виявлені в товстому шарі, що оточує культуру фібробластів. Таким чином, було показано, що в навколоклітинному просторі є гіалуронат, що піддається розщепленню під дією гіалуронідази.

ЕЛАСТИЧНІСТЬ І РЕОЛОГІЯ

Виходячи з розмірів однієї з найбільших молекул гіалуронату, Неважко припустити, що з концентрації близько 1 г/л вони майже повністю насичують розчин. При високих концентраціях молекули переплутуються, а розчин являє собою мережу з ланцюгів гіалуронату. Точка полімеризації визначається досить легко - це момент насичення розчину, після якого його в'язкість різко збільшується зі збільшенням концентрації. Ще однією властивістю розчину, яке залежить від його концентрації, є швидкість зсуву в'язкості. Це явище описали Ogston та Stanier. Еластичні властивості розчину змінюються у міру наростання концентрації та молекулярної маси полімерів. Плинність чистого гіалуронатубула вперше визначена Jensen та Koefoed, і більш докладний аналіз в'язкості та еластичності розчину був виконаний Gibbs et al.

Чи є така цікава поведінка розчину наслідком суто механічного переплетення ланцюжків полімерів або вона пов'язана з їхньою хімічною взаємодією? У ранніх роботах, опублікованих Ogston, було обговорено можливі взаємодії, опосередковані через білки. Welsh із співавторами отримав вказівки на існування взаємодій ланцюжків між собою. Це було досягнуто шляхом додавання коротких ланцюжків гіалуронату (60 дисахаридів) до розчину, що викликало зменшення його еластичності та в'язкості. Очевидно, що при цьому відбувалася конкурентна взаємодія коротких та довгих кіл. У пізніших роботах John Scott було показано, що конформація гіалуронату з наявністю гідрофобних зв'язків між ланцюжками добре відповідала схильності гіалуронату до формування спіралей з молекулами, що знаходяться поруч, які стабілізувалися гідрофобними зв'язками. Таким чином, найбільш ймовірним є міжланцюгова взаємодія, яка багато в чому визначає реологічні властивості. гіалуронату.

ФІЗІОЛОГІЧНА РОЛЬ ГІАЛУРОНОВИХ ПОЛІМЕРІВ

Відкриття переплетення ланцюжків гіалуронатупри наростанні концентрації, що може відбуватися в тканинах, стало основою припущення, що гіалуронат може бути задіяний у багатьох фізіологічних процесах за рахунок створення великої тривимірної мережі ланцюжків. Обговорювалися найрізноманітніші властивості таких мереж.

В'язкість.Дуже висока в'язкість концентрованих розчинів гіалуронату, а також залежність зсуву від в'язкості можуть бути використані для суглобового мастила. Гіалуронат завжди присутній у всіх просторах, що розділяють рухливі елементи організму – у суглобах та між м'язами.

Осмотичний тиск.Осмотичний тиск розчинів гіалуронатузначною мірою залежить від їхньої концентрації. При високих концентраціях колоїдно-осмотичний тиск такого розчину виявляється вищим, ніж у розчинів альбумінів. Ця властивість може бути використана у тканинах для підтримки гомеостазу.

Опір потоку. Щільна мережа ланцюжків є досить гарною перешкодою струму рідини. Гіалуронатдійсно може формувати перешкоди для струму рідини у тканинах, що вперше було показано Day.

Винятковий обсяг.Тривимірна мережа ланцюжків витісняє з розчину решту макромолекул. Доступний обсяг може бути виміряний у досвіді діалізного зрівнювання розчину гіалуронату та буферного розчину, при цьому виявилося, що отриманий ефект збігся з розрахунковими за даними теоретичних досліджень, проведених Ogston. Ефект виключення обговорювався у зв'язку з поділом білка, що міститься в судинному руслі та позаклітинному просторі, проте він також розглядався як механізм накопичення фізіологічних і патологічних молекул у сполучній тканині. Виняток полімерів знижує розчинність багатьох білків.

Дифузійний бар'єр.Рух макромолекул через розчин гіалуронатуможе бути виміряно при седиментаційному та дифузійному аналізі. Чим більша молекула тим нижчою буде швидкість її руху. Цей ефект пов'язували з формуванням у тканинах дифузійних бар'єрів. Наприклад, навколоклітинний шар гіалуронату може захищати клітини від впливу макромолекул, що виділяються іншими клітинами.

ГІАЛУРОН-ЗВ'ЯЗУЮЧІ БІЛКИ (ГІАЛАДГЕРИНИ)

Протеоглікани.До 1972 вважалося, що гіалуронат є інертним з'єднанням і не взаємодіє з іншими макромолекулами. У 1972 році Hardingham і Muir показали, що гіалуронатможе зв'язуватися з протеогліканами хрящової тканини. Дослідження Hascall та Heinegard показали, що гіалуронат може специфічно зв'язуватися з N-кінцевим доменом глобулярної частини протеогліканів та сполучних білків. Даний зв'язок є досить міцним і на один ланцюг гіалуронату можуть сідати кілька протеогліканів, в результаті чого в хрящі та інших тканинах формуються великі агрегації молекул.

Рецептори гіалуронату.У 1972 Pessac і Defendi і Wasteson із співавторами показали, що суспензії деяких клітин починають агрегувати при додаванні гіалуронату. Це було першим повідомленням, яке вказувало на специфічне зв'язування гіалуронатуз поверхнею клітин. У 1979 році Underhill і Toole показали, що гіалуронатдійсно зв'язується клітинами, а в 1985 році був виділений рецептор, що відповідає за це взаємодія. У 1989 році відразу 2 групи авторів опублікували роботи, в яких було показано, що рецептор хоумінгу лімфоцитів CD44 має здатність зв'язуватися з гіалуронатом у хрящовій тканині. Незабаром було показано, що рецептор, виділений Underhill і Toole, був повністю ідентичний CD44. Ще одним гіалуронат-зв'язуючим білком, виділеним пізніше з супернатанту культури клітин 3T3 в 1982 Turley з співавторами виявився РГРП (рецептор гіалуронату, опосередковує рухливість). Після цих робіт було відкрито ще цілу низку гіаладгеринів.

РОЛЬ ГІАЛУРОНАТУ У КЛІТЦІ

Аж до відкриття гіаладгеринів вважалося, що гіалуронат впливає на клітини лише за рахунок фізичних взаємодій. Дані про те, що гіалуронат може відігравати роль у біологічних процесах, були поодинокими і, здебільшого, були побудовані на відсутності або наявності гіалуронату при різних біологічних процесах. Багато спекуляцій того часу були побудовані на методах неспецифічного гістологічного фарбування.

На початку 1970-х у Бостоні було здійснено дуже цікаве дослідження. Bryan Toole і Jerome Gross показали, що під час регенерації кінцівки у пуголовків гіалуронатсинтезується на самому початку, а потім його кількість зменшується під дією гіалуронідази, при цьому відбувається заміщення гіалуронату хондроїтинсульфатом. Так само розвиваються події і при формуванні рогівки у курчати. Toole вказав, що накопичення гіалуронату збігається з періодами міграції клітин у тканині. Як уже було сказано вище, Toole також провів перші дослідження мембранно-пов'язаних гіаладгеринів, а з відкриттям рецепторів гіалуронату у нас є все більше підстав вважати, що гіалуронатграє роль регуляції клітинної активності, наприклад, під час руху клітин. В останні 10 років можна спостерігати сплеск числа публікацій, присвячених ролі гіалуронату у міграції клітин, мітозі, запаленні, пухлинному зростанні, ангіогенезі, заплідненні тощо.

БІОСИНТЕЗ ГІАЛУРОНАТУ

Дослідження біосинтезу гіалуронату можна умовно поділити на 3 фази. Першим автором і найвидатнішим вченим у першу фазу був Albert Dorfman. Він та його колеги ще на початку 50-х описали джерело моносахаридів, які вбудовувалися у гіалуронові ланцюжки стрептококів. У 1955 році Glaser і Brown вперше показали можливість синтезу гіалуронату окремою синтетичною системою поза клітиною. Вони використовували фермент, виділений із клітин курячої саркоми Rous і вводили до складу гіалуронових олігосахаридів мічену ізотопом 14С УТФ-глюкуронову кислоту. Група Dorfman також виділила молекули-попередники УТФ-глюкуронової кислоти та УТФ-N-ацетилглюкозаміну з екстракту стрептококів, а також синтезувала гіалуронат, користуючись при цьому ферментативною фракцією, виділеною зі стрептококів.

У другій фазі стало зрозуміло, що гіалуронат повинен синтезуватися шляхом, відмінному від глікозаміногліканів. Синтез гіалуронату на відміну від сульфатованих полісахаридів не вимагає активного синтезу білка. Відповідальна за це синтаза розташована в мембрані протопласту бактерій та плазматичній мембрані еукаріотичних клітин, але не в апараті Гольджі. Синтетичний апарат, ймовірно, розташований на внутрішній стороні мембрани, так як він виявився нечутливим до дії позаклітинних протеаз. Крім того, гіалуронова ланцюжок пронизує мембрану, так як вплив на клітини гіалуронідази посилювало продукцію гіалуронату. У 80-ті роки було зроблено кілька безуспішних спроб виділити синтазу з еукаріотичних клітин.

На початку 90-х було показано, що гіалуронат-синтаза є фактором вірулентності стрептококів групи А. Взявши ці дані за основу, дві групи авторів змогли визначити ген та локус, який відповідає за синтез гіалуронової капсули. Незабаром вдалося клонувати ген цієї синтази і повністю його просеквенувати. Гомологічні білки, виділені останніми роками у всіх хребетних, дали цінну інформацію про її будову. Важливою областю дослідження може бути вивчення механізмів регуляції активності цієї синтази.

МЕТАБОЛІЗМ І ДЕГРАДАЦІЯ ГІАЛУРОНАТУ

Виявлення гіалуронату в крові, а також його перенесення від тканин за лімфатичною системою стало основою для проведення спільного дослідження, яке проводилося доктором Robert Fraser у Мельбурні та лабораторією у м. Упсала. Слідові кількості полісахариду, міченого тритієм по ацетильній групі, були виявлені в крові після введення його кроликам і людям, а мітка з'єднання зникала з періодом напіввиведення рівним кільком хвилинам. Незабаром стало зрозуміло, що більшість радіації була накопичена печінкою, де полімер швидко піддавався розщепленню. Мічена тритієм вода виявлялася у крові через 20 хвилин. Авторадіограми показали, що накопичення радіації відбувалося також у селезінці, лімфовузлах та кістковому мозку. Методом фракціонування клітин було також показано, що в печінці накопичення відбувалося в основному в ендотелії синусів, що було пізніше підтверджено при дослідженні in vitro та при радіографії in situ. На цих клітинах є рецептор для ендоцитозу гіалуронату, який принципово відрізняється від інших гіалуронат-зв'язуючих білків. Далі полісахарид розщеплюється у лізосомах. Дослідження гіалуронату проводилися і в інших тканинах, і тепер існує цілісна картина метаболізму полісахариду.

Останнім часом ще один аспект катаболізму гіалуронатустав об'єктом великої кількості досліджень. З робіт Gunther Kreil (Австрія) та Robert Stern та його колег (Сан-Франциско) стали відомі структури та властивості різних гіалуронідаз. Ці дані стали основою для досліджень, що прояснили біологічну роль цих ферментів.

ГІАЛУРОНАТ ПРИ РІЗНИХ ЗАХВОРЮВАННЯХ

З самого початку інтерес вчених був прикутий до властивостей гіалуронату, що міститься в суглобовій рідині, особливо до зміни рівня при захворюваннях суглобів. Було також показано, що гіперпродукція гіалуронату спостерігається при низці захворювань, наприклад, при злоякісних пухлинах - мезотеліомах, проте на той час ще не існувало достатньо точних і чутливих методів виявлення гіалуронату. Така ситуація мала місце аж до 1980 років, коли були розроблені нові аналітичні методики, що знову залучило інтерес вчених до коливань змісту гіалуронатупри різних захворюваннях. Було визначено вміст гіалуронату в крові в нормі та при патології, особливо при цирозі печінки. При ревматоїдному артриті вміст гіалуронату в крові зростав при фізичних навантаженнях, особливо вранці, що давало пояснення симптому «ранкової скутості» у суглобах. При різних запальних захворюваннях рівень гіалуронату у крові підвищувався як місцево, і системно. Органні дисфункції також можна пояснити накопиченням гіалуронату, що викликало інтерстиціальні набряки тканин.

КЛІНІЧНЕ ЗАСТОСУВАННЯ

Основний прорив у медичному використанні гіалуронату є заслугою д-ра Balazs. Він розробив основні положення та ідеї, першим синтезував форму гіалуронату, яку добре переносили хворі, просував ідею промислового виробництва гіалуронату та популяризував ідею застосування полісахаридів як лікарські засоби.

У 50-ті роки Balazs сконцентрував зусилля на вивченні складу склоподібного тіла та почав проводити досліди із замінниками для можливого протезування при лікуванні відшарування сітківки. Одним із найбільш серйозних перешкод на шляху застосування гіалуронових протезів стала висока складність виділення чистого гіалуронату, вільного від усіх домішок, що викликають запальну реакцію.

Balazs вирішив цю проблему і препарат, що вийшов в результаті, отримав назву НВФ-NaГУ (незапальна фракція гіалуронатунатрію). У 1970 гіалуронат був вперше введений у суглоби біговим коням, які страждали від артритів, причому була отримана клінічна виражена відповідь на лікування із зменшенням симптомів захворювання. Двома роками пізніше Balazs зміг переконати керівництво компанії Pharmacia AB у м. Уппсала розпочати виробництво гіалуронату для використання у клінічній та ветеринарній практиці. Miller і Stegman за порадою д-ра Balazs почали використовувати гіалуронат у складі імплантованих внутрішньоочних лінз і гіалуронат швидко став одним із найвживаніших компонентів у хірургічній офтальмології, отримавши торгову назву Healon®. З того моменту було запропоновано та випробувано багато інших варіантів використання гіалуронату. Його похідні (наприклад, поперечно структуровані гіалуронати) також були випробувані для використання у клініці. Особливо хочеться відзначити, що ще 1951 року Balazs вже повідомляв про біологічну активність найперших з отриманих тоді похідних гіалуронату.

ВИСНОВОК

У даній доповіді нам вдалося охопити лише основні та найбільш значущі події в історії дослідження гіалуронату, і ще багато інших цікавих фактів та даних обговорюватимуться на нашому веб-сайті. З представлених статей буде ясно, що дослідження гіалуронату стають все більш актуальними та необхідними. Сьогодні щорічно у науковій літературі публікується від 300 до 400 статей, присвячених гіалуронату.

Перша міжнародна конференція, цілком присвячена гіалуронату, проводилася в Сен-Тропез в 1985 році, після чого були проведені конгреси в Лондоні (1988), Стокгольмі (1996) і Падуї (1999).

Зростання інтересу пов'язане, багато в чому, з успішними роботами Endre Balazs, який зробив дуже багато в галузі дослідження властивостей гіалуронату, отримав найперші дані про нього, вказав на можливість клінічного застосування гіалуронатуі є натхненником, що спонукає наукове співтовариство на нові дослідження.