Цель: позволяет дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки, определить морфологические и тинкториальные свойства.

1. Приготовить фиксированный мазок

2. На мазок кладём фильтровальную бумагу

3. На бумагу капнуть 1-2 капли генцианвиолета и окрасить в течение 1 минуты

4. Краску вместе с бумагой смыть (промывать водой не надо)

5. Окрасить препарат раствором Люголя на фильт. бумаге в течение 1 минуты

6. Краску слить и на мазок с фильтр. Бумагой капнуть на 0,5 минуты этилового спирта

7. Промыть препарат водой

8. Окрасить разведённым фуксином Циля в течение 2 минут также на фильтровальной бумаге

9. Промыть водой, подсушить и промикроскопировать

Грам «+» окрашиваются в синий цвет, грамм «-» в розовый.

Методика приготовления мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде.

Приготовить рабочий стол → Зажечь спиртовку и прокалить бактериальную петлю → Петлёй нанести на предметное стекло каплю воды → Петлю обжечь → Петлёй взять небольшое количество исследуемого материала, соблюдая правила стерильности → Перенести материал в каплю воды на предметном стекле и тщательно растереть, чтобы получилось мутное пятно → Петлювновь обжечь → Зафиксировать мазок, проведя над пламенем 3-4 раза → Дать мазку подсохнуть → Окрасить.

Дайте характеристику ГР(+) и ГР(-) бактериям.

Отличия ГР(+) и ГР(-) бактерий

Отношение к окраске по Граму – важный для систематики признак бактерий, который зависит от структуры и химического состава клеточной стенки бактерий. Выделяют две большие группы - грамположительные (“грам+”) и грамотрицательные (“грам-“) бактерии. Стенка грамположительных бактерий после окраски по Граму сохраняет комплекс йода с генциановым фиолетовым (окрашены в сине-фиолетовый цвет), грамотрицательные бактерии теряют этот комплекс и соответствующий цвет после обработки и окрашены в розовый цвет за счет докрашивания фуксином.

Особенности клеточной стенки грамположительных бактерий.

Мощная, толстая, несложно организованная клеточная стенка, в составе которой преобладают пептидогликан и тейхоевые кислоты, нет липополисахаридов (ЛПС), часто нет диаминопимелиновой кислоты.

Особенности клеточной стенки грамотрицательных бактерий.

Клеточная стенка значительно тоньше, чем у грамположительных бактерий, содержит ЛПС, липопротеины, фосфолипиды, диаминопимелиновую кислоту. Устроена более сложно - имеется внешняя мембрана, поэтому клеточная стенка трехслойная.

2. Укажите на предложенной чашке с ЖСА один из дифферинциально-диагностических признаков.

Назовите признак, являющиеся дифференциально-диагностическими для стафилококков.

Дифференциально – диагностический признак: при росте стафилококки образуют пигмент: золотистый лимонно-желтый или белый, который не растворяется в воде и растворяется в ацетоне, эфире, спирте.

На МПА колонии стафилококка выпуклые, круглые, непрозрачные, блестящие, размером 2-4 мм с ровными краями. На агаре с кровью вокруг колонии образуется зона гемолиза. На бульоне – равномерное помутнение и осадок на дне.

На ЖСА вокруг колоний выявляется продукция лецитиназы - мутная зона и «радужные» венчики.

3. Через 10 лет после перенесенного сыпного тифа у больного без повторного заражения появились симптомы этого заболевания. Назвать это явление и используемые методы диагностики.

Рецидив - повторение болезни после кажущегося полного выздоровления.

Основным методом лабораторной диагностики сыпного тифа являются серологические реакций: агглютинации, связывания комплемента и непрямой гемагглютинации. Реакция агглютинации со специфическим диагностикумом из риккетсий Провачека высокочувствительна и становится положительной на 3-5-й день. Диагностическим титром антител считают разведение сыворотки 1: 100-1: 160. Антитела исчезают в течение года после заболевания. РСК бывает положительной с 7-8-го дня болезни; титр антител максимальный к 12-14-му дню, а затем наблюдается медленное снижение. Небольшое количество комплемент- связывающих антител обнаруживают долгие годы. РНГА становится положительной на 7-8-й день заболевания. Диагностическим считают титр антител 1: 160 - І : 200 при условии его дальнейшего нарастания при повторной постановке РНГА.

БИЛЕТ 5

1. Окрасьте препарат метиленовой синью, промикроскопируйте, сделайте вывод.

Расскажите методику приготовления мазка из культуры, выращенной на ЖПС.

Окрасить препарат метиленовой синью:

1. препарат положить на поверхность исследуемым материалом вверх;

2. пипеткой нанести на препарат р-р красителя на 5-7 мин;

3. краску слить, промыть водой;

4. просушить;

5. м/с с иммерсией.

Для приготовления мазка необходимо иметь:

Чистое обезжиренное предметное стекло.

Бактериологическую петлю

Культуру, выращенную на плотной питательной среде - агаре, или жидкой среде - бульоне.

Спиртовку.

Набор красок.

Если мазок готовится с жидкой питательной среды, то каплю культуры на­носят петлей на предметное стекло.

2.Выберите культуры с характерным для сальмонелл ростом на двухсахарной среде.

Перечислите и охарактерактеризуйте исследования для дифференциации этого возбудителя.

3.У больного был взят мазок из зева и посеян на питательную среду. Для фаготипирования был использован стафилококковый бактериофаг, но зоны подавления роста через 24 часа инкубации не появилось.

Дать заключение по этим данным.

БИЛЕТ 6

1.Промикроскопитуйте готовый препарат, сделайте вывод.

Расскажите устройство и правила работы со световым микроскопом.

При работе с микроскопом необходимо соблюдать операции в следующем порядке:

1. Работать с микроскопом следует сидя;

2. Микроскоп осмотреть, вытереть от пыли мягкой салфеткой объективы, окуляр, зеркало;

3. Микроскоп установить перед собой, немного слева на 2-3 см от края стола. Во время работы его не сдвигать;

4. Открыть полностью диафрагму, поднять конденсор в крайнее верхнее положение;

5. Работу с микроскопом всегда начинать с малого увеличения;

6. Опустить объектив 8 х в рабочее положение, т. е. на расстояние 1 см от предметного стекла;

7. Глядя одним глазом в окуляр и пользуясь зеркалом с вогнутой стороной, направить свет от окна в объектив, а затем максимально и равномерно осветить поле зрения;

8. Положить микропрепарат на предметный столик так, чтобы изучаемый объект находился под объективом. Глядя сбоку, опускать объектив при помощи макровинта до тех пор, пока расстояние между нижней линзой объектива и микропрепаратом не станет 4-5 мм;

9. Смотреть одним глазом в окуляр и вращать винт грубой наводки на себя, плавно поднимая объектив до положения, при котором хорошо будет видно изображение объекта. Нельзя смотреть в окуляр и опускать объектив. Фронтальная линза может раздавить покровное стекло, и на ней появятся царапины;

10. Передвигая препарат рукой, найти нужное место, расположить его в центре поля зрения микроскопа;

11. Если изображение не появилось, то надо повторить все операции пунктов 6, 7, 8, 9;

12. Для изучения объекта при большом увеличении сначала нужно поставить выбранный участок в центр поля зрения микроскопа при малом увеличении. Затем поменять объектив на 40 х, поворачивая револьвер, так чтобы он занял рабочее положение. При помощи микрометренного винта добиться хорошего изображения объекта. На коробке микрометренного механизма имеются две риски, а на микрометренном винте - точка, которая должна все время находиться между рисками. Если она выходит за их пределы, ее необходимо возвратить в нормальное положение. При несоблюдении этого правила, микрометренный винт может перестать действовать;

13. По окончании работы с большим увеличением, установить малое увеличение, поднять объектив, снять с рабочего столика препарат, протереть чистой салфеткой все части микроскопа, накрыть его полиэтиленовым пакетом и поставить в шкаф.

2. Произведите учет реакции связывания комплемента (Реакция Вассермана). Назовите цель проводимой реакции и перечислите используемые ингредиенты.

Реакция Вассермана (RW), или ЭДС (экспресс-диагностика сифилиса) - метод диагностики сифилиса

Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты: 1) исследуемая сыворотка, 2) антигены, 3) комплемент, 4) гемолитическая сыворотка, 5) эритроциты барана.

Все ингредиенты для реакции Вассермана берут в одинаковом объеме - 0,5 или 0,25 мл.

Степень положительности реакции Вассермана принято обозначать количеством крестов + + ++ полная задержка гемолиза, жидкость не окрашена, все эритроциты в осадке; + + + выраженная задержка гемолиза, жидкость розовая, эритроциты в осадке; + + частичная задержка гемолиза, жидкость окрашена интенсивно, осадок эритроцитов ясно виден; + слабая задержка гемолиза, жидкость интенсивно окрашена, осадок незначительный, слабо заметен; - полный гемолиз, жидкость окрашена интенсивно, осадка нет

3. В микробиологическую лабораторию поступил материал – биоптат со слизистой желудка с клиническим диагнозом: язвенный гастродуоденит. При посеве исследуемого материала была выделен - H. PYLORI.Методы микробиологического исследования используемые для анализа данной пробы.Методика взятия биоптата со слизистой желудка и 12 – перстной кишки.

ПЦР обычно дает положительный (возбудитель есть) или отрицательный результат (возбудителя нет). Метод ПЦР позволяет выявить даже ничтожно малое количество хеликобактерпилори с целью прогнозирования заболевания, выявления возможной склонности к язвенной болезни, гастриту или раку желудка.

БИЛЕТ 7

1. Промикроскопируйте и опишите морфологические признаки бактерий, из предложенных препаратов (№ 1,2). Дайте характеристику различным морфологическим группам.

По внешнему виду бактерии делятся на три формы: палочковидные, шаровидные (кокки) и извитые (вибрионы и спириллы).

Кокковые формы различаются по форме деления и расположению в мазках. Они делятся в одной, двух, трех и более взаимно перпендикулярных плоскостях. При делении в одной плоскости они располагаются парами (диплококки) или цепочками (стрептококки); в двух плоскостях - по четыре (тетракокки), в трех плоскостях образуют пакеты (сарцины); при беспорядочном делении располагаются одиночно (микрококки) или в виде гроздьев винограда (стафилококки). Извитые формы имеют вид спирали. Микроорганизмы палочковидной формы подразделяются на бактерии, бациллы и клостридии.

К бактериям относятся палочковидные микроорганизмы, не образующие спор (кишечная палочка, сальмонеллы, возбудители туберкулеза и т.д.).

К бациллам и клостридиям (лат. closter - веретено) принадлежат микробы, образующие споры (сибиреязвенная, столбнячная палочки, возбудители анаэробной инфекции).

По форме палочковидные бактерии бывают короткими, длинными или средних размеров: с закругленными (большинство палочек), заостренными (фузобактерии), обрубленными (сибиреязвенная палочка) и булавовидными (коринебактерии) концами. Некоторые бактерии могут образовывать ветвления в виде боковых выростов (микобактерии туберкулеза).

По взаимному расположению палочковидные формы распределяются на три подгруппы:

диплобациллы и диплобактерии располагаются попарно; стрептобактерии и стрептобациллы - цепочками; беспорядочно расположенные бактерии и бациллы - в виде римских цифр II, V и т.д.

Извитые формы бактерий. К этой группе относятся вибрионы, спириллы и спирохеты.

Вибрионы - изгиб клетки равен 1/3-1/4 завитка спирали, имеющие вид запятой (холерный вибрион).

Спириллы имеют изгибы с одним или несколькими оборотами спирали.

Спирохеты имеют штопороподобную форму, размеры колеблются в больших пределах (ширина 0,3- 1,5 мкм и длина 7 - 500 мкм).

Палочковидные формы бактерий, подобно коккам, располагаются по длине парами - диплобактерии или цепочками - стрептобактерии. Палочковидные формы могут быть прямые и искривленные, строго цилиндрические и неравномерно утолщенные, с концами закругленными, заостренными или обрубленными.

В микробиологии окраска по Граму имеет большое значение. Ее применяют для диагностики инфекционных заболеваний, выявления патогенности бактерий. Метод позволяет определить сходные по форме и размеру бактерии, которые относятся к различным видам и родам.

Окраска бактерий по Граму - сложный метод, в котором применяют два вида окраса: основной и дополнительный. В процессе выполнения манипуляции применяют обесцвечивающие вещества, к которым относятся спирты и кислоты.

В микробиологии окраску по Граму проводят трифенилметановой группой красителей. К ней относятся генциановые, метиловый синий, кристаллвиолет. Разные виды бактерий дают разные окрасы, образуя прочные соединения с красителями.

Окрасы

В микробиологии окраска по Граму бывает двух видов: грамположительная и грамотрицательная. В первом случае микроорганизмы дают прочные соединения с красителями и йодом. Во время анализа они не обесцвечиваются при воздействии со спиртом, из-за чего не изменяют своего первоначального фиолетового оттенка.

Грамотрицательные окрасы образуются при воздействии с йодом и легко разрушаются под действием йода. В результате микробы обесцвечиваются, а затем приобретают красный оттенок.

Подготовка материала

По правилам микробиологии, окраска по Граму требует предварительной подготовки материалов. Его необходимо распределить тонким слоем по поверхности стекла. Затем мазок подсушивают и после полного высыхания фиксируют. При этом мазок закрепляется на стекле, что позволяет исключить смывание бактерий красителями. К тому же мертвые микроорганизмы окрашиваются лучше, чем живые.

После подготовки материала подбирают метод окрашивания: физический или химический. Первый предполагает воздействие высокой температуры на микробную клетку. Во время химического способа применяют различные химические вещества, которые вызывают коагуляцию протеинов цитоплазмы.

Подготавливают набор для окраски по Граму, предметные стекла с бактериями. Их берут пинцетом или аккуратно пальцами за ребра мазком вверх, затем проводят пару раз над верхом пламени горелки. Процесс должен занимать пару секунд.

Процесс фиксации химическим методом предполагает использование ацетона, спирта, специальных смесей, жидкость Карнуа. Предметное стекло с высушенным мазком погружают в фиксирующее вещество на пятнадцать минут, затем просушивают на воздухе.

Окрашивание

Окраска мазков по Граму проводится по определенному алгоритму.

1. Сначала на фиксированный мазок наносят основной краситель на пару минут. Во избежание появления осадка процедуру выполняют с использованием фильтровальной бумаги.
2. Краситель удаляется (сливается), убирается бумага. Мазок погружается в раствор Люголя на две минуты или в йодистый раствор по Граму до почернения препарата.
3. Мазок поласкают спиртовым раствором или ацетоном, наливая и сливая его до тех пор, пока и мазок не обесцветится, и жидкость не станет чистой. Это занимает примерно от 30 до 60 секунд.
4. Стекла тщательно промывают дистиллированной водой.

Чтобы определить, есть ли в мазке грамотрицательные бактерии, проводят дополнительно окрашивание фуксином или сафранином. Препараты наносят на две минуты. В конце процедуры стекло промывают, высушивают.

Результаты

Все грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный. Шарообразные формы обычно относятся к грамположительным видам, а извитые формы - отрицательно окрашиваются. Палочковидные бактерии могут быть грамотрицательными и грамположительными.

Чтобы получить максимально достоверные результаты исследований, рекомендуется применять суточные культуры, а также свежеприготовленные растворы для окрашивания.

Механизм окраски позволяет увидеть и оценить физико-химические особенности строения цитоплазмы, клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. У первых содержится много рибонуклеиновой кислоты, белков в цитоплазме, а в клеточных стенках - пептидогликана. Из-за этого во время обработки мазков генцианвиолетом и Люголем у грамположительных видов бактерий образуется прочное соединение ионов йода и красителя.

При обработке спиртами грамположительные микроорганизмы удерживают краситель, а грамотрицательные - обесцвечиваются и окрашиваются дополнительно разведенным фуксином в красный оттенок. Некоторые бактерии способны окрашиваться только на стадии роста.

Применение

Окраску по Граму проводят при анализе вида микроорганизмов в мазках из влагалища и слюны. Этот способ позволяет определить вид микроорганизмов в кале, в плевральной, перитонеальной жидкости и не только. Любые жидкости, где могут содержаться бактерии, исследуют данным методом. После проведения окрашивания врачи подбирают метод лечения, назначая препараты, способные воздействовать на грамположительные или грамотрицательные бактерии.

Микробиология. Окраска по Граму: красители, проведение, результаты — все о путешествиях на сайт

(или метод Грама) — эмпирически выведенный метод различения бактерий с помощью окрашивания их определенным методом на две большие группы: Грамположительные и Грамотрицательные), различающихся химическими и физическими свойствами их клеточной стенки.

Этимология

Метод называется в честь его изобретателя, датского ученого Ганса Христиана Грама (1853-1938), который разработал этот метод в 1884 году чтобы различить бактерии Pneumococcus и Klebsiella pneumoniae.

Использование

Окраска по Граму — одна из самых полезных красящих процедур в лабораторных исследованиях в микробиологии. Процедура широко используется как инструмент для различения Грамм-отрицательных и Грам-положительных бактерий, обычно являются первым шагом в определении идентичности специфического бактериального образца.

В медицине окрашивания по Граму выполняется при анализе крови или биопсии, когда подозревается инфекция. Этот метод гораздо быстрее, чем культура, и особенно важен, когда определение типа инфекции необходимо для прогноза и выбора метода лечения. Например, при диагностике цереброспинальной жидкости менингитом и жидкости суставов на септический артрит.

При анализе, например, Коки и спороносные формы бактерий, а также дрожжи — грам-положительные и окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, большинство других бактерий — грамотрицательные и окрашиваются в красный цвет, ядра клеток эукариот приобретают ярко красного цвета, а цитоплазма — розового.

Техника проведения окрашивания

Окраска по Граму относится к сложному способу окрашивания, когда на мазок влияют двумя красителями, из которых один является основным, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обезбарвлюючи вещества: спирт, кислоты и др. Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметанового группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристалл виолет. Грам-положительные (грамм (+)) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, в результате чего при дополнительном окраске фуксином Грамм (+) микроорганизмы не меняют сначала присоединен фиолетовый цвет.

Грамотрицательные (грамм (-)) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом соединения, легко разрушается под действием спирта. В результате микробы обесцвечиваются и потом окрашиваются фуксином, приобретая красного цвета.

Подготовка материала для окраски

Материал исследуемого распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют.

Фиксация

При фиксации мазок закрепляется на поверхности стекла, и поэтому при дальнейшем окрашивании препарата клетки не смываются. Кроме того, убиты микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. Различают физический способ фиксации, в основу которого положена действие высокой температуры на клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации Стекло с препаратом берут пинцетом и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют таким приемом: свободную от мазка поверхность стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильной фиксации стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущение ожога (70-80 ° С).

Химический способ фиксации Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96% и наркозного эфира в соотношении 1: 1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96% — 60%, хлороформа 30%, ледяной уксусной кислоты 10 %). Стекло с высушенным мазком погружают в стакан с фиксирующей веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.

Процесс окрашивания

1. На фиксированный мазок наливают один из основных красителей на 2-3 минуты. Чтобы избежать осадка красят через фильтровальную бумагу.
2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя или йодистым раствором, по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2: 1) в почернение препарата.
3. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96 ° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок НЕ обесцветится и жидкость стекает, не станет чистой (примерно 20-40-60 секунд).
4. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.
5. Для выявления грамотрицательных бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранина (2-5 мин).
6. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Все известные бактерии по способности окрашиваться по методу Грама делятся на положительных и отрицательных. Это разделение зависит от особенностей строения и окраски их клеточной стенки.

Метод позволяет разделить все виды в зависимости от плотности строения наружной оболочки клетки микроорганизма на:

• более устойчивых к воздействию окружающей среды, влиянию антибиотиков;
• менее устойчивых.

Первым ученым, предположившим, что некоторые методы, ранее используемые только в ботанике, могут использоваться в микробиологии, был Роберт Кох.

В 1884 г. Кристиан Грам, датский биолог, специализирующийся на окраске тканей, впервые попробовал метод дифференцирующей окраски.

Открытие позволило разделить все существующие виды микроорганизмов на грамположительные и грамотрицательные, что послужило толчком для новой ступени развития науки в области микробиологических исследований. Это также дало возможность выявлять устойчивость патогенных видов к лекарственным препараты, предугадывать их поведение, а что самое главное – разрабатывать антибиотики нового поколения, способные победить болезнь.

Строение клеточной стенки

Оболочка любой бактерии состоит из специального вещества – муреина. Его молекула представляет собой цепи полисахаридов, расположенных параллельно. Полисахариды, в свою очередь, связаны между собой цепями аминокислот, расположенных перекрестно.

Данная связь обуславливает крепкость, упругость оболочки, ее способность держать форму. Своеобразная плетеная сетка является защитой внутреннего слоя микроорганизма от действия разрушающих факторов, препятствует попаданию внутрь воды. При этом просветы между цепочками позволяют клетке поглощать питательные вещества, словно поры.

У положительных по Граму микроорганизмов оболочка толще, прочнее, что обусловлено включением в ее состав белка.

У отрицательных видов строение клеточной оболочки значительно сложнее, что позволяет ей быть защищенной от действия таких сред, как слюна, желудочный сок, другие жидкости с содержащимся в них лизоцимом – ферментом, обладающим антибактериальными свойствами. Снаружи более тонкая оболочка окружена пленкой из липидов и полисахаридов – гладким поверхностным слоем.

Сущность метода Грама

Основой метода Грама является принцип разделения бактерий на микроорганизмы со знаками «плюс» и «минус» по Граму, основываясь на разном химическом составе клеточных стенок микроорганизмов.

Для определения грамположительных и грамотрицательных бактерий препарат, нанесенный на стекло тонким равномерным слоем, вначале фиксируют с помощью нагревания над горелкой. Затем окрашивают анилиновым красителем – метиловым фиолетовым. После чего фиксируют йодом, дают подсохнуть и смывают при помощи спирта.

• Грамположительные (Грам +) виды приобретают ярко-синюю окраску.
• Грамотрицательные (Грам –) бактерии обесцвечиваются.

Заключающим этапом является окрашивание препарата контрастным красителем красного цвета, который позволяет получить грамотрицательные микроорганизмы красного или розового цвета. Это обусловлено тем, что краситель не может проникнуть в клетку из-за толстого ее внешнего слоя, окрашивая только поверхность.

Мертвые микробы приобретают более яркую окраску, по сравнению с живыми.

Характеристика бактерий, положительных по Граму

Большинство грамположительных бактерий являются патогенными для человека. Это возбудители опасных заболеваний:

1. Стрептококк (Streptococcus), вызывающий тонзиллиты, фарингиты, ревматизм.
2. Стафилококк (Staphylococcus) – возбудитель заражения крови, кожных гнойных заболеваний.
3. Листерия (Listeria), вызывающая листериоз – воспаление мозга.
4. Бациллы (Bacillus) – возбудители токсикоинфекций, сибирской язвы.
5. Клостридии (Clostridium), вызывающие ботулизм, столбняк, газовую гангрену.

Два последних вида являются спорообразующими анаэробами, остальные не могут образовывать спор. Некоторые способны окрашиваться только в фазе активного роста.

Отрицательные бактерии по Граму

Это полностью обесцвечивающиеся после промывки спиртом бактерии; в результате повторной окраски сафранином приобретают розовый или ярко-красный цвет. Они более устойчивы к антителам, чем виды Грам +.

К грамотрицательным относятся в основном бактерии условно патогенные, способные вызвать воспалительные процессы и иммунный ответ в организме человека при определенных условиях. Их клеточная оболочка, состоящая из липополисахаридного слоя, вызывает синтез цитокинов, что способствует увеличению токсинов в месте локализации воспаления. Впоследствии токсины, разнесенные с кровотоком, отравляющим действием вызывают сильнейшие симптомы интоксикации.

Важная роль метода Грама в диагностике заболеваний

Метод, позволяющий отличить положительные бактерии по Граму и отрицательные, незаменим при исследовании человеческого биологического материала на выявление бактериальной инфекции.

Материал, используемый для диагностики:

• мокрота позволяет классифицировать состав микрофлоры носоглотки, обнаружив возбудителей заболеваний;
• в анализе кала обнаруживают токсины, вырабатываемые грамположительными видами;
• мазок из влагалища дает возможность посчитать процент грамотрицательных и положительных микробов для диагностики бактериальных вагинитов;
• плевральная, синовиальная, перинатальная жидкости также являются достаточно информативными.

Метод, внедренный Кристианом Грамом, позволил науке далеко продвинуться в знаниях о строении микробов, об их защитных механизмах. Он позволил ввести самую верную систему разделения бактерий на положительные и отрицательные, используемую до сих пор для диагностики инфекционных болезней.

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://allbest.ru

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Окраска по Граму

Овчаровой Анны Игоревны

студентки 3 курса,

специальность «Биология»

Минск, 2016

Введение

1. Техника проведения окраски

1.1 Подготовка материала для окраски

1.2 Фиксация

1.2.1 Физический способ фиксации

1.2.2 Химический способ фиксации

1.3 Процесс окрашивания мазков

2. Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту

2.1 Модификация Hucker

2.2 Модификация Burke

2.3 Модификация Kopeloff-Beerman

2.4 Модификация Preston-Morrell

3. Ошибки

3.1 Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет

3.2 Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет

ВВЕДЕНИЕ

В зависимости от строения клеточной стенки прокариоты, относящиеся к эубактериям, делятся на две большие группы. Было обнаружено, что если фиксированные клетки эубактерий обработать сначала кристаллическим фиолетовым, а затем йодом, образуется окрашенный комплекс.

При последующей обработке спиртом в зависимости от строения клеточной стенки судьба комплекса различна: у так называемых грамположительных видов этот комплекс удерживается клеткой, и последние остаются окрашенными, у грамотрицательных видов, наоборот, окрашенный комплекс вымывается из клеток, и они обесцвечиваются. (Этот способ был впервые предложен в 1884 г. датским ученым Х. Грамом (Ch. Gram), занимавшимся окрашиванием тканей. Позднее он был использован для бактерий).

У некоторых эубактерий положительная реакция при окрашивании описанным выше способом свойственна только клеткам, находящимся в стадии активного роста. Выяснено, что окрашенный комплекс образуется на протопласте, но его удерживание клеткой или вымывание из нее при последующей обработке спиртом определяются особенностями строения клеточной стенки. Окрашивание препаратов увеличивает чувствительность микроскопии, так как неокрашенные бактерии плохо различимы даже при увеличении в 400-1000.

Наиболее распространена дифференциальная окраска по Граму, хотя применяют и монохромные окраски. Окраска по Граму позволяет отличить бактерии, чья толстая клеточная стенка практически полностью состоит из пептидогликана (грамположительные), от бактерий, чья клеточная стенка помимо тонкого слоя пептидогликана имеет наружную мембрану, состоящую из липопротеидов и липополисахаридов (грамотрицательных). Основный краситель (например, кристаллический фиолетовый) прочно фиксируется в стенке грамположительных бактерий, придавая им иссиня-черный цвет, и легко вымывается спиртом (или ацетоном) из стенки грамотрицательных бактерий, после чего они докрашиваются контрастным красителем (например, сафранином) в красный цвет.

Окраска по Граму незаменима при исследовании мазков мокроты. Если мокрота получена правильно, в ней обнаруживают не менее 25 нейтрофилов и менее 10 эпителиальных клеток в поле зрения при малом увеличении. Большее количество эпителиальных клеток и разнообразие типов бактерий свидетельствуют о том, что мокрота загрязнена содержимым ротоглотки. Хотя отличить нормальную микрофлору от патогенных бактерий нередко бывает трудно, окраска мазка по Граму дает ценную информацию, если патогенная бактерия имеет какой-либо доступный определению признак (биологический сигнал). Например, при бактериальном вагинозе в мазке из влагалища видны эпителиальные клетки, усеянные грамположительными бактериями.

Микроскопию мазков кала, окрашенных по Граму, используют как отборочное исследование. При обнаружении нейтрофилов приступают к бактериологическому исследованию и определению токсинов, вырабатываемых Clostridium difficile .

Окраску по Граму используют также для выявления бактерий и лейкоцитов в СМЖ, синовиальной, плевральной и перитонеальной жидкости. Нижний предел чувствительности метода составляет 10000 бактерий на 1 мл.

Чтобы увеличить чувствительность, исследуемую жидкость центрифугируют и готовят окрашенный мазок осадка. Эта процедура называется обогащением материала. Она проста и особенно ценна для выявления бактерий и лейкоцитов в СМЖ и кислотоустойчивых бактерий в мокроте.

1. ТЕХНИКА ПРОВЕДЕНИЯ ОКРАСКИ

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой -- дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные Грам (?) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легкоразрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

1.1 Подготовка материала для окраски

Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла.

Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. Гистологические срезы готовят по рутинной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.

1.2 Фиксация

При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваютсялучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

1.2.1 Физический способ фиксации

Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2--3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксациидолжен занимать не более 2 с.

Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметногостекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стеклодолжно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70--80 °С).

1.2.2 Химический способ фиксации

Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 %и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % -- 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10--15 минут и затем высушивают на воздухе.

1.3 Процесс окрашивания мазков

1 На фиксированный мазок наливают один из осномвных красителей на 2 или 3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.

1. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1--2 мин раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1--2 минуты до почернения препарата.

2. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20--40--60 секунд).

3. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1--2 мин.

4. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2--5 мин).

5. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

2. Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту

1. Депарафинированные срезы доводят до воды.

2. Окрашивают 20 мин в 1% растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).

3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.

4. Окрашивают 5 мин в 1% кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.

5. Быстро ополаскивают в 1% растворе хлорида натрия.

6. Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.

7. Промокают фильтровальной бумагой.

8. Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 -- 2 мл); растворы сливаютдо тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.

9. Проводят через 3 смены ксилола

10. Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.

Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.

2.1 Модификация Hucker

гистологический окрашивание бактерия

2.2 Модификация Burke

2. Окраска основным красителем. На мазок наливают раствор а и добавляют 2-3 капли раствора b (2-3 мин).

4. Промыть водопроводной водой и осторожно удалить избыток воды фильтровальной бумагой (не сушить).

7. Докрасить дополнительным красителем. (5-10 сек).

2.3 Модификация Kopeloff-Beerman

1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют.

2. Окраска основным красителем. Растворы а и b смешивают в соотношении 15:4. Наносят на мазок (5 мин и более).

3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более).

4. Стряхнуть избыток раствора Люголя. Не промывать.

5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек).

6. Препарат высушить на воздухе.

7. Докрасить дополнительным красителем. (1-2 мин).

8. Промыть и подсушить препарат.

2.4 Модификация Preston-Morrell

1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин).

2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек).

3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин).

4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить.

5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить.

6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек).

7. Промыть и подсушить препарат.

3. Ошибки

3.1 Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет

Мазок переобесцвечен (самая частая ошибка)	· Приготовить новый мазок и повторить окраску, уменьшив время обработки обесцвечивающим раствором · Просмотреть много полей зрения в испорченном мазке. Иногда удается найти подходящие · Если нет возможности приготовить новый мазок, полностью обесцветить имеющийся, тщательно промыть водой, высушить и повторить окраску
Старая культура	· Окраска по Граму учитывается для суточных культур (для медленно растущих бактерий - через двое-трое суток). При длительном хранении на питательной среде наблюдается дегенарация муреинового слоя. Используйте культуру подходящего возраста
Культура выращена в неблагоприятных условиях	· При выращивании на селективных средах может образовываться слишком тонкий муреиновый слой · Культивируйте микроорганизм на полноценной среде

3.2 Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет

Слишком густой мазок или наличие конгломератов (например, при аутоагглютинации)	· Краситель удерживается не клеточной стенкой, а за счет капиллярности пространств между клетками в скоплении · Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальной "густотой" мазка · Повторить приготовление препарата, взяв меньше культуры и приготовив мазок на большей площади · При аутоагглютинации культуры взять для приготовления мазка дистиллированную воду
Мазок плохо обесцвечен	· Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальным обесцвечиванием · Повторить приготовление препарата и его окраску · Дообесцветить имеющийся мазок · Проверить правильность приготовления обесцвечивающего раствора. При повторении ошибки - заменить раствор.
Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии)

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

Особенности строения клеток бактерий, постоянные и непостоянные компоненты бактериальной клетки и принципы их окраски по Граму. Пропионово-кислое брожение и способы питания микроорганизмов. Санитарная оценка масла по микробиологическим показателям.

контрольная работа , добавлен 21.10.2010


Определение назначения и описание механизма гистохимических методов идентификации химических веществ в гистологических срезах. Описание электронной, люминесцентной и ультрафиолетовой микроскопии. Радиоавтография и культура клеток и тканей вне организма.

реферат , добавлен 09.09.2014


Техника приготовления гистологических препаратов для световой микроскопии, основные этапы данного процесса и требования к условиям его реализации. Методы исследования в гистологии и цитологии. Примерная схема окраски препаратов гематоксилин – эозином.

контрольная работа , добавлен 08.10.2013


История систематического изучения закономерностей эволюции тканей. Теория параллелизма гистологических структур. Теория дивергентной эволюции тканей. Теория филэмбриогенеза в гистологии. Эпителиальная, производные мезенхимы, мышечная и нервная ткань.

презентация , добавлен 12.11.2015


Слоистые каменные структуры (строматолиты) - результат жизнедеятельности бактерий как древнейшей группы организмов. Изучение бактерий, форма и строение бактерий, их размеры и распространение. Классификация бактерий по способу питания, размножение.

презентация , добавлен 14.10.2011


Методы изучения морфологии микроорганизмов при микроскопии препаратов, приготовленных из чистых культур путем окрашивания. Способы витальной окраски микроорганизмов для избежания артефактов, появляющихся в результате токсического действия красителя.

презентация , добавлен 23.02.2016


Разделение водорослей на систематические группы высшего ранга, его совпадение с характером окраски и чертами строения. Клеточные оболочки водорослей. Бесполое и половое размножение водорослей. Черты сходства и различия желто-зеленых и зеленых водорослей.

реферат , добавлен 09.06.2011


Питание бактерий. Способы поступления питательных веществ в клетку. Классификация бактерий по типам питания, источникам энергии и электронам. Пропионовокислое брожение, его основные участники, их характеристика, использование в народном хозяйстве.

контрольная работа , добавлен 29.11.2010


История и общая характеристика группы, описание ее пород, отличительные особенности и свойства. Окраска собак и принципы ее наследования. Особенности генетики окрасов и других селекционно-важных признаков собак группы "Буль", психические особенности.

дипломная работа , добавлен 20.04.2012


Понятие и механизм функционирования вкусовой сенсорной системы (вкусовой анализатор, орган вкуса). Трансдукция вкусового сигнала и основные нарушения. Обобщение повреждающих агентов. Усовершенствование метода окраска метиленовым синим вкусовых клеток.